神经生长因子对兔牙髓干细胞体外增殖、成骨分化影响的实验研究

目的:探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)体外增殖及成骨分化的影响,为牙髓组织的损伤修复提供新线索。方法:采用酶解组织块法分离培养健康新西兰兔的DPSCs,光镜下观察其形态学及生长变化。将培养的第3代DPSCs分为3组:空白组(只有DPSCs)、实验组(DPSCs混合100μg/L NGF)和对照组(DPSCs混合矿化液)。观察实验7 d和14 d时3组的细胞形态及碱性磷酸酶活性结果,RT-qPCR检测各组Runx-2、COL-1以及OCN的基因表达水平。结果:体外培养的DPSCs生长良好,贴壁生长,大多为多角形或长梭形,呈巢式或集落生长;3组的碱性磷酸酶活性在实验14 d时均高于实验7 d时的数值,且7 d和14 d时实验组与空白组、对照组差异均有统计学意义(P<0.05);RT-qPCR结果显示培养14 d时实验组中Runx-2、COL-1和OCN基因的表达量均高于空白组(P<0.05)。结论:NGF可以提高DPSCs的增殖和成骨分化能力,两者的联合应用修复效果优于DPSCs单独应用。

髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死

背景:牙髓干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能,在骨和软骨组织工程中的应用取得了明显进展,因此研究牙髓干细胞对股骨头坏死的治疗作用,将为股骨头坏死患者带来新的治疗策略和希望。目的:观察髓芯减压联合牙髓干细胞对兔早期激素型股骨头坏死的治疗作用。方法:成年健康新西兰大白兔52只,随机分为正常对照组、模型组、溶媒组、牙髓干细胞组,除正常对照组外,其余3组采用激素型股骨头坏死造模方法。造模成功后(第4周),溶媒组和牙髓干细胞组右侧行髓芯减压术,牙髓干细胞组于股骨头减压孔注射牙髓干细胞,溶媒组同时注射同体积生理盐水,第4,5,6周共注射3次。第12周检测骨密度、骨形态学参数、空骨陷窝率、骨小梁面积比等指标。结果与结论:①影像学检查提示溶媒组和牙髓干细胞组治疗效果均较模型组有显著改善;与溶媒组比较,牙髓干细胞组骨体积分数、骨小梁数量、骨密度改善更明显,差异有显著性意义(P<0.05);②牙髓干细胞组空骨陷窝率和骨小梁面积比与正常对照组更为接近,溶媒组空骨陷窝率高于正常对照组(P<0.05),骨小梁面积比低于正常对照组(P<0.05);溶媒组和牙髓干细胞组空骨陷窝率明显低于模型组(P<0.05),骨小梁面积比明显高于模型组(P<0.05);③结果表明,牙髓干细胞联合髓芯减压治疗早期股骨头坏死优于单纯髓芯减压。

加味肾气丸联合髓芯减压术、人牙髓基质干细胞移植对兔早期激素性股骨头坏死的治疗作用研究

目的观察加味肾气丸联合髓芯减压术、人牙髓基质干细胞(hDPSCs)移植对兔早期激素性股骨头坏死的治疗作用。方法将50只日本雄性大耳白兔随机分为正常组、模型组、髓芯减压组(以下简称髓减组)、髓芯减压+干细胞移植组(以下简称髓减干移组)、髓芯减压+干细胞移植+加味肾气丸组(以下简称髓减干移加味肾气丸组),每组10只。除正常组外其余各组均通过肌肉注射醋酸泼尼松龙注射液建立激素性股骨头坏死模型,正常组肌肉注射0.9%氯化钠注射液。正常组和模型组造模期间不予任何干预,髓减组于造模第4周给予髓芯减压术治疗,髓减干移组于造模第4周后予髓芯减压术+hDPSCs移植治疗,髓减干移加味肾气丸组在开始造模第1天即开始进行加味肾气丸灌胃治疗,每周2次,连续灌胃12周,于造模第4周后予髓芯减压术+hDPSCs移植治疗。比较各组造模第12周空骨陷窝率、血清血管内皮生长因子(VEGF)水平变化情况,并通过Micro CT检测计算各组造模第12周骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、结构模型指数(SMI)、骨密度(BMD)变化情况。结果与正常组比较,模型组造模第12周空骨陷窝率升高(P<0.05);与模型组比较,髓减组、髓减干移组、髓减干移加味肾气丸组造模第12周空骨陷窝率均降低(P<0.05),且3个治疗组组间比较差异也均有统计学意义(P<0.05),髓减干移加味肾气丸组水平最低,其次是髓减干移组,最后是髓减组。与正常组比较,模型组造模第12周后血清VEGF水平降低(P<0.05);与模型组比较,髓减组、髓减干移组、髓减干移加味肾气丸组造模第12周血清VEGF水平均升高(P<0.05),且3个治疗组组间比较差异也均有统计学意义(P<0.05),髓减干移加味肾气丸组水平最高,其次是髓减干移组,最后是髓减组。与正常组比较,模型组造模第12周BV/TV、Tb.Th、Tb.N、BMD均降低(P<0.05),Tb.Sp、SMI均升高(P<0.05);与模型组比较,髓减组、髓减干移组、髓减干移加味肾气丸组造模第12周BV/TV、Tb.Th、Tb.N、BMD均升高(P<0.05),Tb.Sp、SMI均降低(P<0.05);3个治疗组组间比较,髓减干移组、髓减干移加味肾气丸组造模第12周BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、SMI改善均优于髓减组(P<0.05),髓减干移加味肾气丸组BV/TV、Tb.N、Tb.Sp、SMI改善均优于髓减干移组(P<0.05)。结论加味肾气丸联合髓芯减压术、hDPSCs移植治疗早期激素性股骨头坏死兔模型疗效确切,可有效促进坏死股骨头血管再生,改善局部血运,促进骨细胞增殖,促进骨组织修复,多种方案联合治疗具有明显优势。

转化生长因子β3促进兔牙髓干细胞成骨向分化的体外实验研究

目的:探讨转化生长因子β3(TGF-β3)体外诱导兔牙髓干细胞(rDPSCs)骨向分化的效果及其作用机制。方法:酶解组织块法分离的rDPSCs分为实验组(rDPSCs+80 ng/ml TGF-β3),对照组(rDPSCs+矿化液)和空白组(rDPSCs),免疫细胞化学染色法行COL-I、OCN, Runx-2染色;RT-qPCR检测各组ALP、COL-I、OCN、Runx-2表达水平;茜素红(ARS)染色观察矿化结节。结果:免疫细胞化学染色结果示实验组成骨蛋白表达明显强于其余2 组;RT-qPCR结果显示实验组中成骨基因的表达均高于其余2 组(P<0.05);实验组矿化结节形成数高于其余2组(P<0.05)。结论:TGF-β3能促进rDPSCs骨向分化。

兔牙髓干细胞与雪旺细胞体外间接共培养对增殖和兔牙髓干细胞成神经向分化的研究

目的:体外间接共培养兔牙髓干细胞(rabbit dental pulp stems cells,rDPSCs)与兔雪旺细胞(rabbit Schwann cells,rSCs),研究两种细胞对彼此增殖的影响以及rSCs诱导rDPSCs神经向分化的可能性。方法:通过Transwell间接共培养系统构建rSCs/rDPSCs间接共培养体系,采用MTT法检测两种细胞对彼此增殖的影响;通过免疫荧光染色和Western bolt检测S-100β和NF-H的表达,研究rSCs诱导rDPSCs神经向分化的可能性。结果:将rDPSCs与rSCs以1∶2比例间接共培养5 d时,rDPSCs能够促进rSCs的增殖(P<0.05),同时rSCs对rDPSCs的增殖也有明显的促进作用(P<0.05);在与rSCs间接共培养7 d与14 d后,rDPSCs形态与神经细胞类似,并表达S-100β和NF-H,并且14 d时两种蛋白表达更高(P<0.01)。结论:将rDPSCs与rSCs间接共培养,5 d时rDPSCs与rSCs能显著促进彼此的增殖,且rSCs能诱导rDPSCs神经向分化。

转化生长因子β3促进兔牙髓干细胞成骨向分化机制的初步研究

目的探讨转化生长因子β3(transforming growth factorβ3,TGF-β3)体外联合兔牙髓干细胞(rabbit dental pulp stem cells,r DPSCs)诱导其成骨向分化的作用机制。方法酶解组织块法分离获得r DPSCs;将r DPSCs分为实验组(r DPSCs+80μg/L TGF-β3)、对照组(r DPSCs+矿化液)和空白组(r DPSCs),3组细胞分别培养7、14 d后行ALP活性定量检测; RT-qPCR检测COL-1A1、Runx-2、OPN、BSP和Smad4基因的表达; Western blot法检测COL-1A1和Runx-2蛋白的表达情况;茜素红染色观察矿化结节形成情况。结果成功分离获得r DPSCs;实验组ALP含量明显高于对照组和空白组(P<0.05); COL-1A1、Runx-2、OPN、BSP、Smad4基因的表达均高于空白组(P<0.05); COL-1A1、Smad4基因的表达高于对照组(P<0.05); Western blot结果示实验组COL-1A1和Runx-2蛋白的表达均强于其余两组(P<0.05);实验组矿化结节较其余两组明显。结论 TGF-β3体外促进r DPSCs成骨向分化; TGF-β3促进r DPSCs成骨向分化可能通过激活Smad通路来实现。

兔牙髓细胞的体外增殖及鉴定

背景:牙髓干细胞的多分化潜能、高扩增速率和容易获取使之成为引人注目的间充质干细胞来源。目的:观察兔牙髓细胞增殖特性并进行细胞表面标志物的鉴定。方法:体外分离培养兔牙髓细胞,采用酶解组织块法培养细胞至第3代观察细胞形态变化、计数细胞活率、细胞克隆形成率、细胞生长曲线、细胞增殖周期以及细胞表面标志物的鉴定。结果与结论:酶解组织块法可以较快的收获各代兔牙髓细胞。第3代到第6代细胞活率分别比为94.7%∶95.8%∶95.2%∶95.3%,细胞的克隆形成率为18个/2000;细胞的生长曲线基本符合间充质细胞特征,细胞周期G0/G1期大于80%;免疫细胞化学vimentin、CD44、osteonectin、Dsp均为阳性表达。证实兔牙髓细胞中可分离培养出牙髓干细胞,并能在体外有效增殖。

转化生长因子-β_3和牙髓干细胞在兔面神经损伤修复中作用

目的探讨再生室内联合应用牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)和转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)修复兔面神经横断性损伤的可行性,比较各时间段不同药物干预后面神经的恢复情况。方法健康成年新西兰大白兔36只,随机分为DPSCs+TGF-β3组(实验组)、TGF-β3组和PBS组,每组各12只,3组均于兔左面颊部分离面神经上颊支并切断,利用硅胶管作为再生室桥接离断的神经上颊支,建立面神经上颊支横断伤模型。实验组在再生室内加入100ng/μL TGF-β3液和1×108/LDPSCs悬液0.1mL,TGF-β3组加入等量100ng/μL TGF-β3液,PBS组加入等量PBS液,术后4、12周比较3组兔面神经修复再生情况。结果4、12周时实验组神经纤维数[(1 034.58±94.28)、(1 425.92±188.98)根]和纤维直径[(2.05±0.14)、(7.18±0.40)μm]高于TGF-β3组[(935.00±44.60)、(1 053.42±135.26)根,(1.56±0.12)、(6.21±0.47)μm]和PBS组[(555.50±80.20)、(694.36±24.11)根,(1.26±0.08)、(3.64±0.56)μm](P<0.05);12周时3组再生神经纤维总数和纤维直径均高于4周时(P<0.05)。结论 TGF-β3与DPSCs联合应用可有效促进面神经再生,二者联合应用较单用TGF-β3修复效果好;DPSCs可作为种子细胞应用于面神经组织工程。

外源性转化生长因子-β_3联合兔牙髓干细胞对兔骨缺损处成骨细胞转化生长因子-β_3表达的影响

目的探讨转化生长因子-β_3(transforming growth factor-β_3,TGF-β3)联合体外培养的兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)对兔骨缺损处成骨细胞TGF-β_3表达的影响。方法 37只新西兰大白兔,取其中1只兔牙髓组织采用酶解组织块法分离培养获得DPSCs,体外培养,光镜下行细胞形态学观察,将DPSCs传代至第3代,冷冻储存待用。余36只新西兰大白兔随机分为PBS组、DPSCs组、TGF-β_3+DPSCs组,每组12只。在兔下颌前牙及磨牙区颊侧随机人工制备约8mm×2mm×3mm骨缺损区域,PBS组植入Bio-Oss粗颗粒骨粉0.30g+PBS 20μL,DPSCs组植入Bio-Oss粗颗粒骨粉0.30g+1×108/L DPSCs 20μL,TGF-β3+DPSCs组植入Bio-Oss粗颗粒骨粉0.30g+1×108/L DPSCs20μL+80ng/L TGF-β320μL。术后第4、8周3组分别处死6只兔,在骨缺损处行锥形束CT检查观察牙槽骨长度、宽度和高度丧失情况,采用茜素红染色观察骨缺损处骨愈合情况,采用免疫组织化学法观察种植体骨缺损处成骨细胞TGF-β_3表达水平。结果原代培养的兔DPSCs呈集落生长,多呈梭形,少数呈多角形或纺锤形;术后4周TGF-β_3+DPSCs组茜素红染色较PBS组、DPSCs组出现更多红色钙化结节,术后8周钙化结节进一步增多;术后4、8周,TGF-β_3+DPSCs组牙槽骨长度、宽度和高度丧失均少于DPSCs组和PBS组,DPSCs组少于PBS组(P<0.05);术后4周,TGF-β_3+DPSCs组成骨细胞TGF-β_3表达水平(0.33±0.02)明显高于DPSCs组(0.15±0.01)和PBS组(0.09±0.03)(P<0.05),DPSCs组与PBS组比较差异无统计学意义(P>0.05);术后8周,TGF-β_3+DPSCs组成骨细胞TGF-β_3表达水平(0.46±0.01)明显高于PBS组(0.29±0.02)(P<0.05),与DPSCs组(0.38±0.04)比较差异无统计学意义(P>0.05),DPSCs组与PBS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 DPSCs具有高度增殖的生物学特性,并具有成骨向分化潜能;外源性TGF-β_3联合DPSCs可增强内源性TGF-β_3的表达。

不同方法提取兔牙髓干细胞对其生物学特征的影响

目的采用不同方法提取兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs),比较其生物学特征差异。方法健康新西兰幼兔6只,随机分为观察组和对照组各3只,观察组采用下颌骨下缘根尖孔途径法、对照组采用劈牙冠取牙髓法取牙髓组织,记录2组提取牙髓组织所需时间。2组牙髓组织DPSCs接种至DMEM培养基中培养、传代,显微镜下观察细胞形态。取第1代DPSCs,锥虫蓝染色后计数存活细胞和死亡细胞,计算存活细胞率;姬姆萨染色后显微镜下观察细胞克隆数;第1代DPSCs培养第1、3、5、7、9天,采用血细胞计数器行细胞计数计算增殖细胞数;取第3代DPSCs,茜素红染色后观察钙化结节数。结果观察组提取牙髓组织所需时间[(72.3±5.6)s]较对照组[(283.0±15.1)s]少(P<0.05);与对照组比较,观察组DPSCs较致密,细胞间杂质相对较少;观察组第1代DPSCs细胞存活率[(95.5±6.2)%]、克隆团形成数[(19.00±0.82)个]高于对照组[(93.0±5.8)%、(16.00±1.15)个](P<0.05);培养第1天,观察组增殖细胞数[(41 000±221)个]较对照组[(43 929±215)个]少(P<0.05),培养第3、5、7、9天,观察组增殖细胞数[(70 000±236)、(120 286±216)、(167 943±164)、(177 729±103)个]与对照组[(70 043±231)、(120 457±225)、(167 914±257)、(177 900±110)个]比较差异均无统计学意义(P>0.05);培养14d,观察组第3代细胞钙化结节数[(6.70±0.75)个]与对照组[(6.43±0.53)个]比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论下颌骨下缘根尖孔途径法提取DPSCs较简便、省时,所提取的DPSCs中杂质少,具有细胞存活率高、细胞克隆团形成能力强、增殖能力强等优势。

肝素促进转化生长因子-β_3在体外诱导兔牙髓干细胞成骨向分化中的作用

目的探讨转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β_3联合肝素在体外诱导兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成骨向分化中的能力。方法新西兰幼兔4只,采用酶解组织块法分离培养兔DPSCs,传代培养至第3代兔DPSCs,分为空白对照组、TGF-β_3组和TGF-β_3+肝素组;空白对照组正常培养,TGF-β_3组在细胞培养基中加入20μg/L TGF-β_3,TGF-β_3+肝素组在细胞培养基中同时加入20μg/L TGF-β_3和5u/mL肝素。采用碱性磷酸酶(alkailine phosphate,ALP)试剂盒检测各组兔DPSCs成骨向诱导后第7、14天细胞内ALP活性,细胞爬片采用免疫细胞化学法检测成骨细胞标记物RUNT相关转录因子2(runt related transcription factor 2,RUNX-2)和骨钙素(osteocalcin,OC)表达情况,采用茜素红染色观察矿化结节形成情况。结果兔DPSCs在诱导体系中生长状态良好;TGF-β_3+肝素组第7、14天ALP活性[(27.20±1.01)、(29.06±1.39)u/(mg·pro)]高于TGF-β_3组[(12.69±1.03)、(9.44±1.05)u/(mg·pro)]和对照组[(5.96±3.68)、(6.10±3.66)u/(mg·pro)](P<0.01),TGF-β_3组高于对照组(P<0.01);TGF-β_3组和TGF-β_3+肝素组成骨诱导第7天RUNX-2开始出现阳性表达,第14天OC有阳性表达,对照组均为阴性;第21天茜素红染色对照组为阴性,TGF-β_3组为阳性,TGF-β_3+肝素组为强阳性。结论肝素有促进TGF-β_3体外诱导兔DPSCs成骨向分化的能力。

牙髓干细胞来源外泌体修复兔颞下颌关节软骨损伤后软骨组织修复的实验研究

目的:研究牙髓干细胞来源外泌体在兔体内对颞下颌关节软骨损伤的修复能力。方法:由兔前牙及磨牙获取牙髓干细胞,差速离心法分离外泌体并利用透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析,免疫印迹法鉴定。将获得的外泌体种植到兔的损伤软骨组织中,实验组为外泌体组,阳性对照组为透明质酸钠组,对照组为常规手术组,在4、8、12周处死,HE染色观察软骨组织再生情况。结果:成功提取兔牙髓干细胞并提取鉴定外泌体,将外泌体种植到兔损伤软骨组织中,发现其可有效促进损伤软骨组织的修复。结论:牙髓干细胞的外泌体能够有效促进兔颞下颌关节软骨损伤后软骨组织修复能力,为外泌体对组织再生的调控提供依据。