兔斯氏艾美耳球虫荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立荧光定量PCR检测兔斯氏艾美耳球虫的方法。方法根据斯氏艾美耳球虫(内转录间隔区1)ITS1序列区设计特异性引物,构建重组质粒,并作为标准品绘制标准曲线,对建立的荧光定量PCR检测方法进行特异性、敏感性和重复性试验。结果建立的荧光定量PCR能特异性地检测兔斯氏艾美耳球虫,且可检测到含一个卵囊DNA的样本。该方法的重复性较好,组内、组间重复试验的变异系数均小于2%。结论建立了一种特异性好、敏感度高、可靠的检测兔斯氏艾美耳球虫荧光定量PCR方法。

兔斯氏艾美耳球虫环介导等温扩增技术检测方法的建立

建立检测兔斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)环介导等温扩增技术(LAMP)的方法。方法根据E.stiedai的ITS1-5.8s RNA-ITS2基因序列设计特异引物,通过优化反应条件,建立E.stiedai的LAMP检测方法。结果 25μL的反应体系中Bst聚合酶的最优添加量是1.5μL,DNA的最优添加量是75 ng,环引物、内引物和外引物的最优浓度依次是0.8μmol/L、1.6μmol/L和0.15μmol/L,在63℃反应1 h后能特异性地扩增目的基因,并且具有较高的灵敏度。结论建立了E.stiedai的LAMP检测方法,为E.stiedai感染的快速检测提供了新思路。

兔球虫PCR检测方法的改进和应用

兔球虫病由艾美耳属球虫寄生于消化道而引起，对养兔业的危害极大。由于兔艾美耳球虫的11个虫种在致病性上有较大差异，因此进行准确的虫种鉴定对兔球虫病的诊断和防治有十分重要的意义。为提高和扩大PCR方法检测粪便样品中艾美耳球虫的灵敏度和应用范围，我们利用全基因组扩增技术对提取自粪便样品的球虫基因组进行预扩增，提高PCR反应初始模板含量，再利用兔艾美耳球虫ITS-1序列种特异性引物对WGA产物进行PCR扩增，以鉴定虫种。结果显示，经全基因组扩增后的样品的PCR检测能够在单个卵囊的水平上进行虫种鉴定。利用该方法，我们对10份卵囊含量较少的田间兔粪样品进行了PCR检测，对其中的虫种进行了的鉴定。检测结果显示，与卵囊形态鉴定相比，该方法不仅与能确定形态的形态学检测结果一致，还能够检测出形态学不易判断的虫种，体现了更高的准确性。该技术的应用可提高田间样品检测的敏感性和准确度，为兔球虫临床感染情况提供实践指导。