兔角膜基质细胞在壳聚糖胶原共混膜体外培养研究

目的 探讨壳聚糖 胶原共混膜作为载体体外培养兔角膜基质细胞的可行性。方法 先同时消化角膜上皮及内皮层 ,然后刮去上皮、内皮、前弹力层和后弹力层 ,将剩余的基质层剪碎消化 ,接种在壳聚糖 胶原共混膜上 ,通过间接免疫荧光细胞化学染色对培养的细胞进行鉴别。结果 角膜基质细胞应用消化培养法 4h后部分基质细胞与壳聚糖 胶原共混膜有贴壁现象出现 ,细胞呈梭形。培养 2 4h后 ,基质细胞呈纺锤形且透明 ,此后细胞分裂增殖越来越多并向周围延伸 ,培养第 6天细胞已经达到完全融合状态 ,呈梭形 ,排列比较整齐。在 6d左右达到 10 0 %融合状态 ,间接免疫荧光细胞化学染色、Vim染色、胞浆染色阳性。结论 传代的细胞具有角膜基质细胞的生物特性 ,壳聚糖

壳聚糖-硫酸软骨素共混膜与兔角膜基质细胞相容性的研究

为了探讨硫酸软骨素对壳聚糖膜与兔角膜基质细胞相容性的影响,在制备了不同壳聚糖-硫酸软骨素共混膜的基础上,以壳聚糖-硫酸软骨素共混膜作为载体培养兔角膜基质细胞,研究兔角膜基质细胞在共混膜上贴附、生长和代谢的情况,并观察了细胞的形态结构。结果发现,硫酸软骨素的混入可以有效地提高免角膜基质细胞在膜上的贴附和生长速度,促进蛋白质的代谢,降低共混膜对细胞的损伤,有利于细胞在膜上长成密集单层,预示了以一定比例混入硫酸软骨素可以显著提高壳聚糖膜与兔角膜基质细胞的相容性,壳聚糖-硫酸软骨素共混膜具有作为兔角膜基质细胞培养和移植载体的潜能。

胸腺肽β4对H_2O_2诱导的兔角膜基质细胞氧化应激损伤及继发细胞凋亡的抑制作用

目的探讨胸腺肽β4(Tβ4)对H_2O_2诱导的兔角膜基质细胞氧化应激损伤及继发的细胞凋亡的抑制作用。方法采用组织块培养法获得原代兔角膜基质细胞,选取传代的兔角膜基质细胞,根据实验目的将细胞分为3组:正常组、H_2O_2组以及治疗组。H_2O_2组细胞用200μmol·L^(-1)的H_2O_2处理4 h,随后更换为不含FBS的DMEM/F-12培养液继续培养细胞48 h。治疗组细胞则是在H_2O_2处理后换用含终浓度为1μg·mL^(-1)Tβ4的无FBS的DMEM/F-12培养液继续培养48 h。同时把按常规方法培养的兔角膜基质细胞设立为正常组。采用CCK-8法检测各组细胞活性;应用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐探针检测细胞活性氧水平;实时荧光定量PCR检测细胞中过氧化氢酶和锰超氧化物歧化酶mRNA的相对表达量;采用TUNEL法检测细胞凋亡率。ELISA法检测细胞中Caspase-3蛋白的表达。结果组织块培养法培养的兔角膜基质细胞呈多角形,规则排列呈束状。正常组细胞活性为(100.00±0.00)%、H_2O_2组(66.41±9.28)%、治疗组(82.54±7.72)%;H_2O_2组细胞活性明显低于正常组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组细胞活性明显高于H_2O_2组,差异有统计学意义(P<0.01)。正常组细胞活性氧水平为(4.12±0.93)%、H_2O_2组(77.84±6.98)%、治疗组(59.48±8.92)%;与正常组相比,H_2O_2组细胞呈现明显的强阳性着染;H_2O_2组细胞的活性氧水平明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组细胞的活性氧水平明显低于H_2O_2组,差异有统计学意义(P<0.01)。H_2O_2组细胞过氧化氢酶及锰超氧化物歧化酶mRNA的相对表达量较正常组均明显下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05);治疗组细胞过氧化氢酶及锰超氧化物歧化酶mRNA的相对表达量较H_2O_2组均显著升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。正常组细胞凋亡率为(6.81±1.48)%、H_2O_2组(76.14±6.12)%、治疗组(39.04±7.47)%;H_2O_2组细胞凋亡率明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组细胞凋亡率明显低于H_2O_2组,差异有统计学意义(P<0.01)。正常组细胞内Caspase-3蛋白的质量浓度为(0.46±0.09)ng·mL^(-1)、H_2O_2组(0.95±0.08)ng·mL^(-1)、治疗组(0.56±0.17)ng·mL^(-1);H_2O_2组细胞内Caspase-3蛋白的质量浓度较正常组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组细胞内Caspase-3蛋白的质量浓度明显低于H_2O_2组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 H_2O_2可诱导兔角膜基质细胞发生氧化应激损伤并继发细胞凋亡,而Tβ4对细胞的氧化应激损伤及细胞凋亡有抑制作用,其作用机制可能与Tβ4对细胞内Caspase-3、过氧化氢酶和锰超氧化物歧化酶表达的调节有关。