兔骨髓间充质干细胞在兔角膜缘干细胞完全缺乏模型眼表的分化

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(BMSC)移植到兔角膜缘干细胞完全缺乏模型后是否能分化成角膜上皮细胞。方法 3~5月龄清洁级日本大耳白兔24只,采用全周角膜缘板层切除术加中央角膜上皮刮除术建立兔右眼角膜缘干细胞完全缺乏模型,4周后观察眼表形态,行苏木素-伊红(HE)染色、过碘酸-雪夫(PAS)染色及DAPI染色鉴定模型成功与否,选取成功模型18只(36只眼),应用随机数字表法分为对照组(18只兔左眼)、模型组、羊膜组、羊膜加BMSC组,后3组每组6只(兔右眼)。取第三代(P3)兔BMSC,以去上皮羊膜为载体培养观察,待细胞铺满羊膜达90%以上时进行移植手术,于移植术后12周观察兔右眼表形态,行HE染色观察角膜结构,免疫荧光检测兔BMSC分化方向。结果建模后4周有21只兔右眼眼表形态评分达到7分及7分以上,行HE染色、PAS染色、DAPI染色,结果显示角膜缘及角膜上皮细胞层被清除,浅基质层大量炎症细胞浸润及新生血管形成,可见杯状细胞形成,说明模型构建成功。移植术后12周照相观察眼表形态,与自身兔左眼角膜相比,模型组兔右眼角膜混浊,有大量新生血管,羊膜组右眼角膜轻度混浊,有少量新生血管,羊膜加BMSC组兔右眼角膜透明,未见新生血管;HE染色显示羊膜加BMSC组角膜结构修复完整,免疫荧光检测到羊膜加BMSC组有角膜分化的特异性标记因子CK3+12表达,而羊膜组未见表达。结论兔BMSC移植到兔角膜缘干细胞完全缺乏模型后,在体内能够分化成角膜上皮细胞或角膜样上皮细胞,恢复眼表结构及功能。

角膜缘干细胞缺乏动物模型建立方法研究进展

角膜缘干细胞缺乏(LSCD)是眼科常见疾病,严重的LSCD是角膜病致盲的主要原因之一。LSCD新疗法的探索仍是当今研究的热点。建立LSCD动物模型有助于更深入了解LSCD的发病机制以及评估治疗方法的有效性。目前,LSCD建模的主要方式有机械法、灼烧法、化学法、化学+手术法及基因敲减法。机械法成熟可靠,应用广泛,但可能会引起严重的机械损伤。其中,使用旋转毛刺工具造模损伤均匀且创伤小,但对于工具的使用需要一定的经验积累。灼烧法造模表型稳定,但操作复杂可控性差。化学法造模快速简单,病因与临床病例的吻合度较高,但损伤的深度及范围不可控。化学+手术法角膜表面光滑平整,但易导致角膜中央与角膜缘厚度不一致,影响新生血管生长。基因敲减法复杂且动物饲养困难,应用较少。虽然造模方法众多,但各研究中的造模质量参差不齐。因此,建立可靠、成功率高的LSCD动物模型十分必要。本文就近年来常用LSCD动物模型的建立方法及优缺点进行综述,以期为后续构建合适模型提供借鉴。

兔全角膜缘干细胞缺乏模型的构建和鉴定

背景角膜缘干细胞缺乏（LSCD）可导致各种眼表功能异常，严重的LSCD会导致角膜结膜化、慢性炎症、持续的角膜上皮缺失、角膜混浊和伴发的长期视力丧失。目的研究成功构建兔全LSCD模型的适宜方法和最佳时间，观察造模后各时间点模型眼角膜的病理结构改变。方法选择3～5月龄健康日本大耳白兔20只，用手术刀切除左眼360。角膜缘内1mm、角膜缘外2mm的角膜缘上皮组织和剩余的全部中央角膜上皮组织和浅层基质，切除组织厚度为100～150μm。分别在术后2～5周行裂隙灯检查，以角膜混浊、角膜新生血管情况和上皮荧光素钠染色情况为观察指标，按照国际通用LSCD模型评分标准对模型眼进行评分。分别于术后2、3、4、5周获取模型眼的角膜组织标本，行苏木精一伊红染色和过碘酸希夫染色观察角膜组织结构和杯状细胞的改变，用间接免疫荧光染色法检测细胞角蛋白3（CK3）在角膜组织中的表达。手术后不同时间点造模成功率的差异比较采用Fisher精确概率法。结果术后第2、3、4、5周时的模型成功率分别为12．5％、62．5％、81．3％和87．5％，术后第3周造模成功率明显高于第2周，差异有统计学意义（P=0．009）；第3周与第4周相比差异无统计学意义（P=0．465），第3周与第5周相比差异有统计学意义（P=0．049），第4周与第5周相比差异无统计学意义（P=0．200）。造模成功的平均时间为（3．21±0．80）周。造模成功的标准为模型眼角膜明显混浊，角膜新生血管形成和荧光素钠染色阳性。模型眼的组织病理学检查示角膜基质水肿，较多炎性细胞浸润和新生血管形成。过碘酸希夫染色发现，仅在造模后第5周的角膜组织中发现杯状细胞。各时间点造模成功模型眼角膜组织中均未见到CK3阳性表达。结论用手术切除角膜缘及全部中央角膜上皮的方法可以成功构建全LSCD动物模型，造模成功的时间约为手术后3．2周。

角膜缘干细胞缺失病理模型不同手术方法的比较

为探索一种制作角膜缘干细胞缺损病理模型的理想手术方法。采用“一刀法”、“一剪法”和“刀剪结合法”制作家兔和山羊角膜缘干细胞缺损病理模型,用植床外观特征比较手术效果。结果表明,“一刀法”完成的角巩缘切口整齐美观,但植床表面的切痕深浅不一;“一剪法”完成的角巩缘切口痕迹不显且不规整,而植床表面平整;说明“刀剪结合法”完成的角巩缘切口整齐美观且植床表面平整。说明“刀剪结合法”是制作角膜缘干细胞缺损病理模型的理想手术方法。

不同诱导剂对体外角膜缘干细胞培养的影响

眼表重建常用的羊膜移植或自体角膜缘干细胞移植的方法,对眼表组织损伤过大,且对眼表自身干细胞缺乏者临床效果较差.我们常采用体外培养自体角膜缘干细胞后联合生物载体进行眼表移植重建.本实验对兔角膜缘干细胞进行体外培养,观察不同的诱导环境对干细胞最终的繁殖分化的影响.

眼部碱烧伤导致兔角膜缘干细胞缺乏动物模型的建立与评价

目的建立标准的碱烧伤导致的角膜缘干细胞缺乏模型，并对模型进行评价，为研究临床治疗提供动物模型。方法实验研究。于2013年10月至2014年6月在山东中医药大学将18只新西兰大白兔随机分为A组：1mol／L氢氧化钠溶液浸泡的环形滤纸角膜缘贴附烧伤60s＋50μl 1mol／L氢氧化钠溶液滴人结膜囊30s；B组：1mol／L氢氧化钠溶液浸泡的环形滤纸角膜缘贴附烧伤30s＋50μl1mol／L氢氧化钠溶液滴人结膜囊30s，C组：1moUL氢氧化钠溶液浸泡的环形滤纸角膜缘贴附烧伤30S共3组。造模后观察各组新生血管长入角膜及睑球粘连情况，并行活体共聚焦显微镜、印迹细胞学、泪液分泌试验等检查。结果A组模型中6“只”眼均出现角膜穿孔、眼球萎缩。B组6“只”眼烧伤后4周时角膜新生血管长人，睑球粘连均为中度，而C组6“只”眼则无睑球粘连出现。B、C组12“只”眼：角膜缘新生血管在烧伤后1周开始长人，4周时几乎长满角膜；4周时，共焦显微镜检查示角膜缘典型的栅栏结构消失，角膜结膜化，出现杯状细胞，泪液分泌实验与对照眼差异有统计学意义（P〈0．05），B、C组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论环形滤纸片浸润氢氧化钠溶液烧伤角膜缘组织，同时结膜囊滴人氢氧化钠溶液可以成功构建眼部碱烧伤导致角膜缘干细胞缺乏的动物模型。