丹参注射液对兔软骨细胞增殖与凋亡的影响

目的:观察丹参注射液对兔软骨细胞增殖与凋亡的影响。方法:取健康4周龄新西兰大白兔24只,取膝关节软骨组织并建立兔膝软骨细胞体外培养体系,采用四甲基偶氮噻唑蓝比色法(MTT)检测软骨细胞2-5代的增长曲线;采用梯度时间法优化丹参注射液干预软骨细胞活性的时效及量效关系;采用RT-PCR法检测各组软骨细胞B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bax的表达。结果:第2-5代细胞的增殖曲线趋势:第1天各代细胞光密度值(OD值)没有显著差异(P>0.05),第2天增殖缓慢,第3天增殖逐渐加快,第4天进入生长期,第5、6天增殖变慢,第7、8天增殖进入平台期,第9、10天增殖抑制。OD值随细胞传代,呈减低趋势,第1、3代OD值高于第4、5代,但没有显著差异(P>0.05)。时效关系:2组干预24小时OD值没有显著差异(P>0.05),干预48小时OD值中剂量组大于对照组(P<0.05),干预72、96小时OD值中剂量组大于对照组(P<0.01),中剂量组干预72小时OD值显著大于24、48、96小时(P<0.05),故选择细胞干预72小时作为以后实验检测时间点。量效关系:第3代软骨细胞用不同丹参注射液终浓度的10%FBS DMEM溶液干预,干预前细胞OD值没有明显差异(P>0.05);干预72小时后,400、200、100、50、25μg/L浓度细胞的OD值显著大于0μg/L浓度的OD值(P<0.01);50μg/L浓度的OD值显著大于400、200、100、25μg/L浓度的OD值(P<0.01);100μg/L浓度的OD值显著大于400、200、25μg/L浓度的OD值(P<0.01);100μg/L与50μg/L比较细胞OD值没有显著差异(P>0.05)。Bcl-2、Bax表达:诱导凋亡的第3代软骨细胞,加丹参注射液干预24小时后,细胞Bax表达中、高剂量组小于模型组(P<0.05),高剂量组小于低剂量组(P<0.05);细胞Bcl-2表达中、高剂量组大于模型组(P<0.05),高剂量组大于低剂量组(P<0.05)。结论:丹参注射液能抑制软骨细胞调亡;可能通过下调软骨细胞促凋亡因子Bax的基因表达,上调软骨细胞促凋亡因子Bcl-2的基因表达,抑制软骨细胞线粒体调亡通路的信号转导实现。

新鲜与冷冻同种异体胎兔软骨移植

选用家兔５０只，１０只孕兔为移植供体，另外４０只分为新鲜和冷冻两组进行实验。切取胎兔软骨，部分移植于新鲜组兔股骨的骸股关节处，另一部分软骨置－１９６℃液氮冷冻保存３周后植于冷冻组兔的相同部位。木后３、６、９、１２周时行形态学、ＨＥ染色、透射电镜、Ｓ－１００蛋白标记染色、氨基酸分析、淋巴细胞转化实验监测。结果表明：同种异体胎兔软骨移植可成活，成活的软骨为透明软骨；新鲜软骨移植组比冷冻组成活率高；冷冻保存对软骨细胞存活是有害的；胎兔软骨移植后也存在吸收退变，同时也可诱导生成新的软骨；新鲜胎儿软骨移植治疗股骨头坏死所致的关节软骨缺损是可行的。

聚乙烯醇联合藻酸钙与兔软骨细胞共培养对兔膝关节软骨缺损修复的影响

目的探讨聚乙烯醇联合藻酸钙(PVA/CaAlg)与兔软骨细胞(ATDC-5)共培养对兔膝关节软骨缺损修复的影响,以及对胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的mRNA表达及Ⅱ型胶原分泌的影响。方法将20只成年新西兰兔随机分为实验组与对照组,每组10例,在右膝关节软骨造缺损模型。将从4周龄新西兰兔膝关节组织中收集的ATDC-5细胞制成细胞悬液,并经培养传代后接种于PVA/CaAlg复合物上。混合培养2周后,将PVA/CaAlg复合物植入实验组的兔造膝关节缺损模型中;对照组缺损区不做处理。结果PVA/CaAlg复合物内ATDC-5细胞活性良好;植入缺损关节12周后,实验组缺损区ATDC-5细胞数量、Ⅱ型胶原的分泌以及IGF-1的mRNA表达量均高于对照组(P<0.05)。结论将PVA/CaAlg复合物与ATDC-5细胞共培养物植入兔膝关节软骨缺损区,能促进Ⅱ型胶原的分泌和IGF-1的mRNA表达,改善缺损区的修复状况。

Genistein对体外培养兔软骨细胞一氧化氮表达的影响

目的:观察受体酪氨酸激酶抑制剂genistein对体外培养兔软骨细胞一氧化氮(NO)表达的影响。方法:兔膝关节软骨细胞传代培养,应用不同浓度genistein干预1、2、3、4天后,通过亚硝酸盐测定检测培养上清液NO表达水平。结果:形态学、甲苯胺蓝染色显示3代以内体外培养软骨细胞保持细胞表型的稳定。在genistein干预后上清液中NO水平下降,下降水平与genistein干预浓度和时间相关。结论:体外培养兔软骨细胞三代以内的细胞具有较好的活性,genistein能有效降低兔软骨细胞NO的表达水平。

搭载淫羊藿苷聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA-ICA)复合支架对兔软骨细胞的影响

目的 本课题探究搭载不同浓度淫羊藿苷的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA-ICA)复合支架对兔软骨细胞的影响,阐明了其作为骨关节炎潜在治疗手段的可能性。方法 本研究将淫羊藿苷和PLGA以不同比例混合,利用静电纺丝技术构建PLGA-ICA复合支架。利用扫描电镜(SEM)观察PLGA-ICA复合支架的表面形貌,测量支架及复合支架直径和接触角;与兔软骨细胞共培养,将细胞分为:空白对照组、0.01%ICA组、0.1%ICA组、1%ICA组、PLGA组、0.01%ICA+PLGA组、0.1%ICA+PLGA组、1%ICA+PLGA组,MTT法检测支架对兔软骨细胞的细胞相容性,并在培养24h后,荧光显微镜下观察兔软骨细胞的细胞黏附与扩散区域面积。结果 扫描电镜表明PLGA支架平均直径为1.58±0.16μm;复合纤维支架的平均直径分别为1.01μm±0.59μm、1.75μm±0.32μm、1.89μm±0.43μm。纯PLGA组的水接触角为88.32±4.57°,随着ICA的浓度增加,其接触角变化范围为82.58°±8.03°-71.25°±0.51°。MTT法检测表明与空白对照组相比,随着ICA的浓度自0.01%-1.00%上升,兔软骨细胞增殖的效果差异有统计学意义(P<0.05),与未进行任何处理的空白PLGA支架组相比,搭载了ICA的复合支架的兔软骨细胞随ICA浓度增加(0.01%-1%)兔软骨细胞增殖的效果差异有统计学意义(P<0.05)。24h后荧光显微镜观察发现与空白对照组相比,随着ICA的浓度自0.01%-1%上升,兔软骨细胞粘附数量明显增加(P<0.05);随着ICA的浓度自0.01%-1%上升,兔软骨细胞复合支架中培养的细胞其扩散区域比单纯PLGA支架的细胞扩散区域增加(P<0.05)。结论 PLGA-ICA复合支架能够促进兔软骨细胞的增殖,在骨关节炎的治疗中有潜在应用价值。

不同循环静压力对兔软骨细胞整合素α1β1的影响

目的观察不同循环静压力对兔关节软骨细胞增殖及其分泌整合素α1β1浓度的影响。方法体外分离培养胎兔关节软骨细胞,取第2代细胞接种到培养板,分别设置正常压力组(正常压力)、高压力1组(172 kPa)和高压力2组(345 kPa),每天干预2 h。连续干预72 h后,以WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测各组细胞吸光度值(OD值),以酶联免疫吸附法检测各组培养上清中整合素α1β1浓度。结果高压力1组与正常压力组比较,OD值和整合素α1β1浓度差异均有统计学意义(P<0.05);高压力2组与正常压力组比较,整合素α1β1浓度差异均有统计学意义(P<0.05);高压力2组与高压力1组比较,OD值和整合素α1β1浓度差异均有统计学意义(P<0.05)。结论低水平循环静压力对软骨细胞的增殖具有促进作用,而高水平循环静压力则表现为抑制作用;细胞增殖情况和其分泌整合素α1β1浓度可能呈负相关关系。

富血小板血浆对兔膝关节软骨缺损模型软骨修复重塑的效果及其机制初步研究

目的:评价富血小板血浆(PRP)对兔膝关节软骨缺损模型软骨的修复重塑作用及机制探讨。方法:选取18只成年新西兰大白兔,建立兔膝关节软骨缺损模型,随机分为实验组和对照组,每组9只。实验组对兔膝关节软骨缺损模型进行PRP关节腔注射0.4 mL(每4周1次),对照组仅进行兔膝关节软骨缺损模型造模,不给予任何干预措施。实验组注射后行组织学检测,采用苏木精-伊红染色(HE染色)、番红-固绿染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测软骨中血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达,观察两组关节软骨修复及血管化情况。结果:(1)对兔膝关节软骨缺损模型进行HE染色,结果显示软骨表面粗糙,完整性破坏,表层软骨出现纤维化变性及软骨严重缺损,造模成功。(2)与对照组比较,实验组HE染色显示软骨表面无裂隙,软骨细胞数量增多,排列紊乱程度减轻,潮线相对完整。通过番红-固绿染色发现,实验组潮线相对完整,软骨组织与骨组织分界线相对明显,软骨中间层细胞呈圆形,着色较淡,排列规律,软骨基质呈均匀浅红色。(3)通过免疫染色TRAP发现,实验组炎症程度相对较低,破骨细胞数量大幅度降低,骨丢失情况较对照相对降低。(4)通过实时荧光定量PCR检测软骨中VEGF mRNA发现,4周后实验组VEGF mRNA表达高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PRP可以加速兔膝关节软骨缺损模型软骨的修复,并与VEGF促进损伤组织的血管化作用密切相关。

新鲜及冷冻同种异体胎兔软骨移植的实验研究

作者通过胎兔软骨移植实验模型的观察，重点对新鲜及冷冻保存的胎兔软骨移植进行比较，并对实验结果分析探讨，为临床应用提供理论依据。选用成年健康家兔５０只，其中１０只孕兔用于移植软骨供体，另外４０只雌雄不限，随机分为新鲜胎兔软骨移植组和－１９６ｏＣ液氮冷冻保存软骨移植组进行实验。将剖腹取出的胎兔软骨一部分移植到新鲜组兔的股骨的髌股关节面处，另一部分软骨置－１９６ｏＣ液氮罐内保存３周后移植到冷冻组兔的相同部位。软骨移植术后３、６、９、１２周时分别进行ＨＥ染色、透射电镜、形态学观察、Ｓ－１００蛋白免疫组化标记染色、氨基酸分析，并于术前、术后２、３、５周时抽血行淋巴细胞转化试验，对移植软骨免疫反应进行监测。实验结果表明，同种异体胎兔软骨移植可以成活，成活的软骨为透明软骨；新鲜软骨比冷冻保存后移植的软骨成活率高，冷冻保存对软骨细胞的存活是有害的。部分胎兔软骨移植后也存在骨质吸收退变，同时可诱导生成新的软骨。氨基酸分析是判断移植成活软骨性质的可靠指标。新鲜胎儿软骨移植治疗股骨头无菌坏死所致的关节软骨缺损是可行的。

富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞不同配比浓度对兔软骨缺损的影响

目的:研究富血小板血浆(PRP)与骨髓间充质干细胞(BMSCs)不同的配比浓度对兔软骨缺损的治疗效果。方法:随机将60只新西兰兔随机分为模型对照组、PRP组(3%)、BMSCs组(1×106/mL)、不同配比浓度的PRP+BMSCs联合组(1∶5,2∶5,3∶5)。建立兔软骨损伤模型,术后第2周靶侧肌肉注射不同配比浓度的PRP与BMSCs,每周1次,连续给药4周。采用Masson's三色染色法,观察关节软骨缺损情况;采用Pineada法进行关节软骨组织学半定量计分,并通过观察患兔术膝切口,了解术后愈合情况。结果:与模型对照组比较,不同配比浓度的PRP与BMSCs联合组中的关节软骨半定量分值均减少(P<0.05)。不同配比浓度的PRP与BMSCs联合组中,关节软骨半定量分值随PRP浓度的增加而减少,关节软骨半定量分值与PRP值呈现线性关系,其中PRP与BMSCs配比浓度为3∶5的效果最为明显,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:PRP,BMSCs在一定程度上可促进骨组织恢复;关节软骨缺损恢复程度与PRP浓度表现出一定的量效关系。

实验兔膝关节软骨的高场强磁共振成像

目的:探讨实验兔膝关节软骨的高场强MRI正常表现以及成像的最佳序列及参数。方法:应用飞利浦Intera 1.5T超导型磁共振扫描仪,分别采用PDW/SPAIR/D,T2W_3D_FFE及3D_WATSc序列对6只实验兔的膝关节行磁共振成像,观察不同序列关节软骨的信号特点,比较各序列的软骨信噪比(signal to noiseration,SNR)及软骨/软骨下骨对比噪声比CNR(contrast to noise ratio,CNR)。结果:兔膝关节软骨在三个序列中均表现为单层均匀的中等或高信号带;PDW/SPAIR/D、T2W_3D_FFE及3D_WATSc各序列的软骨SNR差异无显著性(P=3.840),而软骨/软骨下骨CNR差异有显著性(P=0.045);3D_WATSc序列的软骨/软骨下骨CNR高于PDW/SPAIR/D序列及T2W_3D_FFE序列(P<0.05),而PDW/SPAIR/D序列和T2W_3D_FFE序列间的软骨/软骨下骨CNR差异无显著性(P>0.05)。结论:高场强磁共振下,兔膝关节软骨表现为单层均一信号,三维扰相梯度回波结合水激励技术即3D_WATSc序列,可能是观察实验兔关节软骨的最佳成像序列。

硫酸氨基葡萄糖氯化钾对IL-1β诱导的兔软骨细胞的作用

采用原代培养的兔关节软骨细胞,检测硫酸氨基葡萄糖氯化钾对IL-1β诱导造成的炎性反应的保护作用。加入0.2,2,20μmol/L硫酸氨基葡萄糖氯化钾及10 ng/mL IL-1β48 h后,测定蛋白聚糖酶(Aggrecanase-1,-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达量的变化。结果表明,硫酸氨基葡萄糖氯化钾对于兔软骨细胞无明显增殖和细胞毒作用。对于IL-1β诱导的软骨细胞,硫酸氨基葡萄糖氯化钾可抑制其聚蛋白聚糖酶Aggrecanase mRNA表达量,并可抑制NO释放以及iNOS mRNA表达,与IL-1β模型组相比有极显著差异。硫酸氨基葡萄糖氯化钾保护骨性关节炎的机制与可显著抑制由白介素类炎性因子导致的炎性反应相关。

低频脉冲磁场对兔膝关节软骨细胞白介素-1β、肿瘤坏死因子-α表达与分泌的影响

目的:测定在低频脉冲磁场(Low frequency pulsed electromagnetic field,LFPEMF)刺激的情况下,兔膝关节软骨细胞白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)与肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达与分泌的变化。方法:分离培养由兔骨髓干细胞(Marrow stem cells,MSCs)诱导分化形成的软骨细胞,分别使用不同强度的LFPEMF进行电磁辐射刺激,用免疫印迹法测细胞中IL-1β与TNF-α的表达状况,并用ELISA检测细胞培养液中IL-1β与TNF-α的水平。结果:施加LFPEMF的兔膝关节软骨细胞中IL-1β与TNF-α的表达无明显差异,但其培养液中IL-1β与TNF-α的水平有明显降低,并且随着施加脉冲磁场刺激强度的增加,IL-1β与TNF-α的降低程度增强。结论:LFPEMF可以抑制体外兔膝关节软骨细胞IL-1β与TNF-α的分泌。

共培养人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)和兔关节软骨细胞诱导hUC-MSCs分化成软骨细胞

目的探讨兔膝关节软骨细胞和人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的共培养对hUC-MSCs成软骨诱导分化的影响及共培养的最佳比例。方法分离培养hUC-MSCs和兔膝关节软骨细胞并鉴定其特异性。在Transwell体系中,按1∶4,1∶3,1∶2,1∶1,2∶1,3∶1及4∶1的比例(hUC-MSCs:兔膝关节软骨细胞)共培养。倒置相差显微镜观察细胞的形态与增殖;甲苯胺蓝染色及免疫荧光染色分别检测葡萄糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型胶原(COL2A1)(蛋白水平定性);并对各组细胞爬片进行GAG、COL2A1定量检测;同时用实时定量荧光PCR(pPCR)检测GAG、COL2A1 mRNA表达,观察共培养前后细胞的基质分泌情况。结果共培养21 d后,阳性对照组和实验组细胞甲苯胺蓝染色及免疫荧光反应均呈阳性;GAG、COL2A1含量及mRNA表达量1∶4实验组均要高于其他实验组和阳性对照组。结论 hUC-MSCs和兔关节软骨细胞的共培养可明显促进hUC-MSCs向软骨样细胞诱导分化,且最佳共培养比例为1∶4。

低频脉冲磁场对兔膝关节软骨细胞人白介素1β、肿瘤坏死因子α表达与分泌的影响

目的探讨低频脉冲磁场对兔膝关节软骨细胞人白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达与分泌的影响。方法选择40只健康成年新西兰白兔建立兔膝关节软骨损伤模型,把右膝关节设为治疗组(n=20),每日给予低频脉冲磁场治疗;左膝关节为对照组(n=20),给予假磁场治疗,治疗后1、4周深麻醉处死动物,观察相关指标的变化。结果在同一观察时间点,IL-1β和TNF-α表达量治疗组均明显少于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。治疗组软骨损伤程度较对照组轻微,关节活动度明显大于对照组,outerbridge积分也少于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论低频脉冲磁场治疗骨性关节炎具有简便易行,安全无创等优点,可有效遏制IL-1β、TNF-α的释放,调节分泌作用,从而对骨性关节炎软骨损伤修复具有促进作用。

光固化树脂表层技术在兔关节软骨缺损修复中的实验研究

目的:探讨光固化树脂表层技术对兔关节软骨缺损修复的作用与效果。方法:40只6周龄雄性成年新西兰大白兔建立双股骨关节软骨缺损模型,将全部受试大白兔左侧股骨髁软骨缺损纳入实验组,右侧股骨髁软骨缺损纳入对照组。分别观察两组大白兔术后不同阶段大体观察情况、组织学特征、透视电镜下超微结构特征等。结果:实验组术后各阶段修复组织覆盖面积明显大于对照组,修复组织为透明软骨的比例明显高于对照组,各阶段修复组织评分结果明显低于对照组(P<0.05)。透视电镜下软骨细胞恢复情况较对照组好。结论:光固化树脂表层技术应用于关节软骨缺损的修复中具有比传统钻孔术更好的修复效果,其材料又安全美观,是一种新型关节软骨缺损修复的有效方法,值得推广宣传。

体外培养兔鼻软骨细胞在静态牵张应力作用下增殖活性变化及其临床意义

目的:探讨体外培养的不同年龄兔鼻软骨细胞在5kPa静态牵张应力作用下增殖活性的变化,从而为鼻软骨牵张术前正畸矫治唇腭裂伴发鼻畸形提供理论依据。材料与方法:将第4代体外培养的新生及6周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞置于细胞膜式静态牵张应力施加装置上培养,流式细胞仪检测5kPa静态牵张应力在0～12h内对兔鼻软骨细胞增殖活性的影响。结果:0～10h内5kPa静态牵张应力组软骨细胞增殖指数随着静态牵张应力作用时间的延长不断上升,对体外培养兔鼻软骨细胞具有较大的促增殖作用,增殖指数峰值位于10h处;5kPa静态牵张应力对体外培养的新生兔兔鼻软骨细胞具有更大的促增殖作用。结论:5kPa静态牵张应力可促进体外培养的新生及六周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞增殖活性,提示我们鼻软骨牵张术前正畸方法不仅适用于临床矫治新生儿唇腭裂伴发鼻畸形,而且有可能用于矫治1岁左右婴儿甚至更大年龄患儿的唇腭裂伴发鼻畸形,从而为唇腭裂伴发鼻畸形的矫治开辟一条新的方法。

兔关节软骨细胞的体外琼酯糖凝胶三维培养

对兔关节软骨细胞进行体外琼脂糖凝胶三维培养,观察兔关节软骨细胞体外培养形成基质能力。

以壳聚糖-胶原共混膜为三维支架同种异体工程化软骨的构建

目的探讨以壳聚糖-胶原共混膜为三维支架材料的同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨的能力。方法将分离、培养、扩传兔软骨细胞,接种在壳聚糖-胶原共混膜上,倒置显微镜下观察细胞在共混膜上的生长情况。体外培养7d后,将细胞-材料复合物种植在新西兰兔皮下,6周取材,对获得的同种异体工程化软骨进行组织学评价。结果兔软骨细胞接种于壳聚糖-胶原共混膜上4h后有贴壁现象出现,细胞呈梭形。培养48h后,软骨细胞分裂增殖越来越多并向周围延伸,培养第7天取材,HE染色示细胞生长良好,呈梭形。体内培养6周取材,HE染色、Masson染色为均一的成熟软骨组织,且共混膜已降解。结论以壳聚糖-胶原共混膜为支架材料同种异体软骨细胞在有免疫力的动物体内可形成工程化软骨。

可降解高分子丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)三维支架的细胞相容性和鼻软骨组织工程

目的探讨可生物降解丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)(80∶20)三维多孔支架生物相容性及用于构建组织工程鼻软骨可行性,为临床鼻软骨缺损的修复提供新来源。方法体外分离培养新生兔关节软骨细胞,采用计算机形态分析和MTT法检测兔软骨细胞在PLGA膜和支架表面粘附、扩展和增殖情况。将培养扩增的兔软骨细胞,按6×106cells/ml浓度接种于预加工的人鼻软骨外形PLGA多孔支架内,抗坏血酸体外诱导培养4周,形成软骨样组织,倒置显微镜、组织切片、扫描电镜观察人工软骨的组织形态结构。结果培养开始阶段,软骨细胞在PLGA膜表面粘附较差,以后逐渐增高,24小时接近于对照组;MTT法结果显示,软骨细胞在PLGA支架内培养7天时细胞绝对数量明显增加,而相对增殖率逐渐下降。肉眼观察,培养物为人鼻软骨外形的透明软骨样组织,具有一定弹性和硬度,表面有大量软骨基质形成;倒置显微镜下可见人工软骨周围有大量软骨细胞聚集和细胞外基质形成。组织切片及扫描电镜分析,多孔支架材料的网孔不完整,孔内有大量软骨细胞和细胞外基质,可见典型软骨陷窝样结构。结论可生物降解PLGA制备的三维多孔支架具有较好生物相容性和可塑性,可用于组织工程鼻软骨体外构建,具有潜在的临床应用价值。