以小球藻为载体生产兔防御素的研究

本研究以单细胞的真核藻类小球藻 (Chlorellaellipsoidea)作为受体 ,将兔防御素 (NP 1)的基因转入后 ,经抗生素筛选和分子及活性检测 ,获得了稳定表达NP 1的转基因藻株。进行了转基因小球藻扩繁的研究 ,并从扩繁的转基因小球藻中提取纯化了具有正常的生物活性NP 1。本文是通过基因工程的途径生产防御素的首例报道 。

兔防御素NP-1基因在转基因番茄中表达的初步研究

兔防御素ＮＰ－ｌ是α-防御素的一种，含３３个氨基酸残基。最初从兔子的多形核嗜中性细胞中分离出来。它对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、分枝杆菌、真菌、被膜病毒以及ＨＩＶ病毒都有不同程度的抑制作用。兔防御素ＮＰ－１所带阳离子较多，可抗不具代谢活性的靶细胞。实验中将兔防御素ＮＰ－１基因构建到植物表达载体中，通过根瘤农杆菌介导转入番茄，得到了转基因番茄植株。对转基因番茄植株进行了 ＰＣＲ． Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂交及体外抑菌检测，证实了兔防御素ＮＰ－ｌ基因已经转入番茄中，并得到了正常的表达，抗病实验表明转基因番茄对番茄青枯病具有抗性，为番茄的抗病育种工作奠定了基础。

利用花粉管通道法将兔防御素NP-1基因导入小麦的研究

兔防御素NP-1是抗性谱最广的防御素之一。为提高小麦的抗病虫能力,培育优质高抗的小麦品种,采用花粉管通道法将兔防御素NP-1基因导入优质小麦品种G8901。对得到的193株T0植株进行抗除草剂筛选,获得4株抗性植株。通过PCR及PCR-Southern杂交,证实了NP-1基因已经整合到转基因植株的基因组中,并稳定遗传到T1。田间抗病虫鉴定结果表明,这些植株对于白粉病、叶锈和条锈病有较强的免疫力和抗性,但对于蚜虫的抗性没有明显提高。

兔防御素NP-1基因在小麦抗病育种中应用的初步研究

兔防御素NP-1是抗性谱最广的防御素之一。为了得到转NP-1基因的小麦植株,采用电激法、基因枪法和花粉管通道法将兔防御素NP-1基因导入普通小麦品种G9501和G8901中,经过抗生素和除草剂初步筛选得到8株G9501和4株G8901的转化植株。田间抗病虫鉴定结果表明,这些植株对于白粉病、叶锈和条锈病的抗性有较大的提高,但对于蚜虫的抗性没有提高,初步认为兔防御素NP-1基因已经导入小麦,并已经在小麦中得到了表达。转基因植株的进一步检测工作正在进行中。

用花粉管通道转化法将兔防御素基因导入新疆陆地棉试验

介绍了用花粉管通道转化方法对新疆陆地棉新陆早7号和新陆早8号进行基因转化的初步研究结果。

兔防御素cDNA表达质粒的构建及其表达

将兔防御素 ( MCP-1 ) c DNA插入真核表达载体 pc DNA3的 Eco R 和 Xba 酶切位点之间 ,构建了兔MCP-1 c DNA的真核表达质粒 pc DEF。通过脂质体转染 ,使兔 MCP-1 c DNA在 COS-7细胞中表达 ,在转染60、84、1 0 8h后 ,提取总 RNA。采用 RT-PCR,在 2 88bp的位置扩增出 1条特异性带 ;RNA斑点印迹杂交表明 ,兔 MCP-1 c DNA在 60、84、1 0 8h均有表达。

利用自剪切融合蛋白在大肠杆菌中表达并纯化兔防御素

将源自兔嗜中性细胞的防御素基因NP-1插入原核表达载体pTYB2,并将重组质粒pTYB2-NP1转入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导使防御素以融合蛋白的形式表达.然后,通过亲和层析利用自剪切融合蛋白分离提纯目的蛋白.蛋白电泳检测到以二聚体形式存在的防御素,但此蛋白没有对大肠杆菌的抑菌活性.同时,对该表达纯化系统的特点和用原核生物大肠杆菌表达真核生物防御素的问题进行了分析和讨论.

设计表达兔防御素基因NP1

利用计算机软件对在将大肠杆菌中表达的兔防御素NP -1基因进行分析。消除宿主菌不表达或低效表达的密码子。同时对NP -1基因与质粒 pGEX -4T -1中融合基因GST进行RNA二级结构预测 ,通过对RNA二级结构进行分析 ,消除可能影响基因表达的二级结构 ,设计了有利于今后对目的基因的表达的兔防御素基因 ,并在大肠杆菌高效表达。结果表明 :合成基因可以在大肠杆菌中高效表达。

兔防御素基因酵母表达的研究

防御素是由动植物体内产生的一种多肽类抗菌、抗病毒活性物质,本研究根据巴斯德毕赤 酵母偏爱密码子的特性,设计兔防御素NP2基因,并构建巴斯德毕赤酵母的表达质粒pGAPZα-NP2,通 过LiCl法转入巴斯德毕赤酵母中,筛选和检测结果表明,兔防御素NP2基因已经成功地转入巴斯德毕 赤酵母,并得到表达。该实验可为兔防御素NP2抗菌抗病毒的研究和开发奠定理论和物质基础。

构建大肠杆菌表达GST兔防御素NP-1融合蛋白表达载体的研究

利用计算机软件对兔防御素基因进行分析,消除大肠杆菌不表达或低效表达密码子。同时利用相关软件对基因进行分析,消除可能影响融合基因表达的一些因素,构建兔防御素大肠杆菌高效表达载体。通过初步表达分析,融合蛋白表达量为菌体总蛋白的27.7％。

转兔防御素基因小球藻异养培养的培养基优化研究

在氮源种类筛选的基础上,采用Plackett-Burman实验设计并结合单因素实验对转兔防御素基因小球藻异养培养的培养基进行了优化。实验结果表明,采用优化后的Knop异养培养基在250mL摇瓶中进行异养培养,藻细胞密度从优化前的1.5g/L提高到优化后的5.11g/L;摇瓶和5L生物反应器异养培养表明,Knop异养培养基中藻细胞浓度分别为优化前培养基的3.39倍和3.17倍,而兔防御素(NP-1)表达能力基本不变。

利用椭圆小球藻硝酸还原酶缺失突变体为生物反应器表达兔防御素NP-1蛋白

利用转基因小球藻为生物反应器生产兔防御素NP-1蛋白具有重要的应用价值。本研究利用椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)硝酸还原酶(nitratereductase)缺失突变体为受体,构建了包含NPTII基因和硝酸还原酶基因两个筛选标记的兔防御素蛋白表达载体,采用电激法将目的基因转入椭圆小球藻硝酸还原酶缺失突变体nrm-4,获得了正确表达防御素蛋白的转基因藻,从而表明通过硝酸还原酶作为筛选标记基因并结合硝酸还原酶缺失突变体可作为较好的小球藻生物反应器生产模式。

兔防御素基因在毕赤酵母中的串连表达及抑菌机理研究

根据毕赤酵母Pichia pastoris密码子偏爱性重编兔防御素基因(Neutrophils peptide-1,pNP-1),设计4条引物搭桥合成.将pNP-1克隆到pPICZα-A载体,使用同尾酶XhoⅠ和SalⅠ在重组载体上构建多价串联体[pNP-1(2×)]和[pNP-1(3×)],分别对这3个基因进行毕赤酵母表达,表达量依次为3.39、6.39和13.05μg/mL.重组蛋白经溴化氢切割后,对得到的活性产物进行抑菌试验,结果表明,重组pNP-1蛋白对苏云金杆菌Bacillus thuringiensis等革兰阳性菌(G+)及大肠埃希菌Escherichia coli等革兰阴性菌(G-)均有抑菌活性,但对白色念珠菌Candida albicans等真菌没有明显的抑菌活性.对pNP-1抑菌机理研究发现,细胞壁和DNA合成抑制剂对pNP-1抑菌活性有协同作用,而多种蛋白质和RNA合成抑制剂对pNP-1抑菌活性有抑制作用.

氮源对转基因小球藻异养生长及兔防御素表达的影响

在250 ml摇瓶中研究了氮源对转兔防御素(NP-1)基因小球藻的异养生长和NP-1表达的影响,结果表明,转NP-1基因小球藻异养培养的最适氮源为硝酸钾和酵母粉,二者的最佳浓度分别为0.9和9 g/L,藻细胞密度达5.11 g/L,是不添加硝酸钾时细胞密度的1.55倍,而NP-1表达量基本不变. 5 L生物反应器分批培养结果表明,转NP-1基因小球藻在含有硝酸钾和酵母粉两种混合氮源的培养基中培养时,硝酸钾被快速消耗而有机氮源充足,藻细胞内的叶绿素和蛋白质含量下降,但NP-1表达量基本不变.

转兔防御素基因小球藻培养的营养模式研究

在250mL摇瓶中研究了光自养、异养、混合营养3种营养模式对转兔防御素基因(NP-1)小球藻(Chlorella)的生长、NP-1表达量、总蛋白质含量、pH、葡萄糖消耗以及光衰减等几个方面的影响。结果表明,异养培养为转NP-1基因小球藻的最适营养模式。在此基础上,采用5,15,30L生物反应器补料分批异养培养转NP-1基因小球藻,细胞质量浓度分别达到3.67,4.87,6.39g/L。

转兔防御素基因小球藻生物反应器异养培养工艺研究

根据5L生物反应器中转兔防御素(NP-1)基因小球藻培养过程特征,建立了基于在补糖、补KNO3、Ph和溶氧(DO)控制的5L生物反应器中进行转NP-1基因小球藻异养培养的工艺,同时将此培养工艺放大到15L生物反应器中.转NP-1基因小球藻在15L反应器中培养133h的细胞密度可达34.2g/L,平均生长速率为0.257g/(L·h),比5L生物反应器中培养131h的细胞密度27.8g/L和平均生长速率0.21g/(L·h)分别提高了23%和22%.研究结果证实了转NP-1基因小球藻放大培养的可行性,为实现高密度、高表达的大规模培养奠定了基础.

小麦花粉管途径转化及高效筛选体系的建立

本文报道了一种从大量花粉管途径转化处理后代中快速有效地筛选到转基因植株的方法。转化质粒为含bar筛选标记基因的天麻抗真菌蛋白(GAFP)与兔防御素(NP-1)双价抗病基因植物表达载体(pBI35S-gafp-NP1-bar),受体小麦品种为扬麦158和Alondra。对花粉管途径转化处理获得的种子分3步进行筛选鉴定:首先,转化处理种子密播于塑料盘中,待小苗长到3叶期时,用浓度为120mg/L的Basta除草剂弥雾喷施筛选,约10d后绝大部分小苗变黄枯死,只有约1%的高抗Basta除草剂的T0小苗存活;然后对其Basta抗性植株用gafp基因引物进行PCR检测,其中62.5%的Basta抗性植株为PCR阳性;最后将T0代PCR阳性植株后代种子(T1)分别发芽并按株系混合取样提取DNA,分别用gafp和bar基因引物进行PCR检测验证,结果均为阳性。表明外源基因已整合入小麦基因组并由T0代植株稳定遗传到T1代,同时证明该筛选方法是可靠有效的。

用基因枪法转化新疆陆地棉新陆早4号

报道了用基因枪轰击转化方法将兔防御素基因NP- 1导入新疆陆地棉栽培品种新陆早4号的转化培养过程,在诱导继代分化过程中对不同培养基进行了比较,发现对于该品种经A1→A3→K3 →K10培养过程得到了转化芽的形成。

彩色棉再生体系影响因子及抗病基因NP-1转化的研究

选用彩色棉优良品种(棕色):新彩1号、新彩2号.以下胚轴和子叶作为外植体,确立了5～6日苗龄的彩色棉下胚轴是较好的愈伤组织诱导外植体.不同激素组合及浓度对愈伤组织的诱导有重要作用,2,4-D是愈伤组织诱导中重要的激素,在附加有0.1mol/L2,4-D+0.1mol/LKT的MSB培养基上,诱导形成的愈伤组织质地疏松、生长旺盛,有利于分化为胚性愈伤.比较了不同糖源在愈伤组织诱导中的效应,在蔗糖和葡萄糖为糖源的培养基中,愈伤组织诱导率均为100%,但葡萄糖更有利于愈伤组织的形成和生长,蔗糖的诱导效果次之;麦芽糖和乳糖对愈伤组织的诱导效应不及蔗糖和葡萄糖;甘露醇作为糖源则抑制了愈伤组织的诱导和生长.在胚性愈伤组织的诱导培养中,KNO3加倍和NH4NO3减半的组合利于胚性愈伤组织的发生.在根癌农杆菌介导的抗病基因兔防御素NP-1转化过程中,外植体经农杆菌浸染10min,共培养48h较为合适,在添加头孢霉素500mg/L、卡那霉素50mg/L的培养基中筛选抗性愈伤组织.