用花粉管通道转化法将兔防御素基因导入新疆陆地棉试验

介绍了用花粉管通道转化方法对新疆陆地棉新陆早7号和新陆早8号进行基因转化的初步研究结果。

设计表达兔防御素基因NP1

利用计算机软件对在将大肠杆菌中表达的兔防御素NP -1基因进行分析。消除宿主菌不表达或低效表达的密码子。同时对NP -1基因与质粒 pGEX -4T -1中融合基因GST进行RNA二级结构预测 ,通过对RNA二级结构进行分析 ,消除可能影响基因表达的二级结构 ,设计了有利于今后对目的基因的表达的兔防御素基因 ,并在大肠杆菌高效表达。结果表明 :合成基因可以在大肠杆菌中高效表达。

兔防御素基因在毕赤酵母中的串连表达及抑菌机理研究

根据毕赤酵母Pichia pastoris密码子偏爱性重编兔防御素基因(Neutrophils peptide-1,pNP-1),设计4条引物搭桥合成.将pNP-1克隆到pPICZα-A载体,使用同尾酶XhoⅠ和SalⅠ在重组载体上构建多价串联体[pNP-1(2×)]和[pNP-1(3×)],分别对这3个基因进行毕赤酵母表达,表达量依次为3.39、6.39和13.05μg/mL.重组蛋白经溴化氢切割后,对得到的活性产物进行抑菌试验,结果表明,重组pNP-1蛋白对苏云金杆菌Bacillus thuringiensis等革兰阳性菌(G+)及大肠埃希菌Escherichia coli等革兰阴性菌(G-)均有抑菌活性,但对白色念珠菌Candida albicans等真菌没有明显的抑菌活性.对pNP-1抑菌机理研究发现,细胞壁和DNA合成抑制剂对pNP-1抑菌活性有协同作用,而多种蛋白质和RNA合成抑制剂对pNP-1抑菌活性有抑制作用.

转兔防御素基因小球藻生物反应器异养培养工艺研究

根据5L生物反应器中转兔防御素(NP-1)基因小球藻培养过程特征,建立了基于在补糖、补KNO3、Ph和溶氧(DO)控制的5L生物反应器中进行转NP-1基因小球藻异养培养的工艺,同时将此培养工艺放大到15L生物反应器中.转NP-1基因小球藻在15L反应器中培养133h的细胞密度可达34.2g/L,平均生长速率为0.257g/(L·h),比5L生物反应器中培养131h的细胞密度27.8g/L和平均生长速率0.21g/(L·h)分别提高了23%和22%.研究结果证实了转NP-1基因小球藻放大培养的可行性,为实现高密度、高表达的大规模培养奠定了基础.

兔防御素NP-1基因在转基因番茄中表达的初步研究

兔防御素ＮＰ－ｌ是α-防御素的一种，含３３个氨基酸残基。最初从兔子的多形核嗜中性细胞中分离出来。它对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、分枝杆菌、真菌、被膜病毒以及ＨＩＶ病毒都有不同程度的抑制作用。兔防御素ＮＰ－１所带阳离子较多，可抗不具代谢活性的靶细胞。实验中将兔防御素ＮＰ－１基因构建到植物表达载体中，通过根瘤农杆菌介导转入番茄，得到了转基因番茄植株。对转基因番茄植株进行了 ＰＣＲ． Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂交及体外抑菌检测，证实了兔防御素ＮＰ－ｌ基因已经转入番茄中，并得到了正常的表达，抗病实验表明转基因番茄对番茄青枯病具有抗性，为番茄的抗病育种工作奠定了基础。

兔防御素NP-1基因在小麦抗病育种中应用的初步研究

兔防御素NP-1是抗性谱最广的防御素之一。为了得到转NP-1基因的小麦植株,采用电激法、基因枪法和花粉管通道法将兔防御素NP-1基因导入普通小麦品种G9501和G8901中,经过抗生素和除草剂初步筛选得到8株G9501和4株G8901的转化植株。田间抗病虫鉴定结果表明,这些植株对于白粉病、叶锈和条锈病的抗性有较大的提高,但对于蚜虫的抗性没有提高,初步认为兔防御素NP-1基因已经导入小麦,并已经在小麦中得到了表达。转基因植株的进一步检测工作正在进行中。

利用花粉管通道法将兔防御素NP-1基因导入小麦的研究

兔防御素NP-1是抗性谱最广的防御素之一。为提高小麦的抗病虫能力,培育优质高抗的小麦品种,采用花粉管通道法将兔防御素NP-1基因导入优质小麦品种G8901。对得到的193株T0植株进行抗除草剂筛选,获得4株抗性植株。通过PCR及PCR-Southern杂交,证实了NP-1基因已经整合到转基因植株的基因组中,并稳定遗传到T1。田间抗病虫鉴定结果表明,这些植株对于白粉病、叶锈和条锈病有较强的免疫力和抗性,但对于蚜虫的抗性没有明显提高。

用基因枪法转化新疆陆地棉新陆早4号

报道了用基因枪轰击转化方法将兔防御素基因NP- 1导入新疆陆地棉栽培品种新陆早4号的转化培养过程,在诱导继代分化过程中对不同培养基进行了比较,发现对于该品种经A1→A3→K3 →K10培养过程得到了转化芽的形成。

小麦花粉管途径转化及高效筛选体系的建立

本文报道了一种从大量花粉管途径转化处理后代中快速有效地筛选到转基因植株的方法。转化质粒为含bar筛选标记基因的天麻抗真菌蛋白(GAFP)与兔防御素(NP-1)双价抗病基因植物表达载体(pBI35S-gafp-NP1-bar),受体小麦品种为扬麦158和Alondra。对花粉管途径转化处理获得的种子分3步进行筛选鉴定:首先,转化处理种子密播于塑料盘中,待小苗长到3叶期时,用浓度为120mg/L的Basta除草剂弥雾喷施筛选,约10d后绝大部分小苗变黄枯死,只有约1%的高抗Basta除草剂的T0小苗存活;然后对其Basta抗性植株用gafp基因引物进行PCR检测,其中62.5%的Basta抗性植株为PCR阳性;最后将T0代PCR阳性植株后代种子(T1)分别发芽并按株系混合取样提取DNA,分别用gafp和bar基因引物进行PCR检测验证,结果均为阳性。表明外源基因已整合入小麦基因组并由T0代植株稳定遗传到T1代,同时证明该筛选方法是可靠有效的。