哺乳动物胰岛素样生长因子酸不稳定亚基的结构与功能

胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factors,IGFs)信号系统是动物体内一条重要的信号通路,广泛作用于机体的生长、发育以及疾病的发生和发展等各种生命活动过程。尽管IGFs系统的各种配体、受体和结合蛋白分子的基因结构、功能及作用机制已被深入地研究,但是有关胰岛素样生长因子酸不稳定亚基(Insulin-like growth factor acid-labile subunit,IGFALS)的功能研究却一直局限于其延长IGFs半衰期方面。近年来,越来越多的研究表明IGFALS基因的突变和蛋白表达量的偏低均可能导致动物体生长发育的延迟甚至缺陷。本文综述了IGFALS基因序列特征、IGFALS蛋白的结构特点及其生物学功能以及表达调控的研究进展,旨在为IGFALS的功能及其作用机制的深入研究提供参考。

人神经生长因子β亚基cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :从海马组织提取中国人神经生长因子基因 (NGFβ) ,分析中国人NGFβ序列 ,再克隆成熟肽部分 ,使NGFβ在大肠杆菌中表达。 方法 :提取组织总RNA进行逆转录 ,克隆到PCRⅡ载体 ,得 6 5 0bpDNA片段 ,以PCRⅡ /NGFβ载体为模板 ,扩增C端成熟肽部分 ,并克隆到PG5中 ,转化大肠杆菌BL2 1用异丙基 - β -D -半乳糖苷(IPTG)诱导培养。表达产物提纯、复性后 ,进行活性测定。结果 :NGFβcDNA全序列为 10 4 7bp ,所克隆的蛋白编码部分为 6 36bp ,由 2 12个氨基酸组成 ,序列分析结果与Genebank完全一致 ,成熟肽部分表达后 ,经SDS -PAGE电泳在 14kD左右有 1条明显的新增蛋白带 ,与预期的分子量相符 ,并Western印迹证实 ,rNGF约占菌体蛋白 10 %左右。结论 :通过序列分析证实 ,重组NGFβ在大肠杆菌中获得较高水平的表达 。

重组人神经生长因子β亚基的原核优势表达及纯化

目的:在原核系统内表达SUMO融合重组人神经生长因子β亚基(h NGF-β),并对其纯化。方法:将5'端引入了羟胺切割位点的h NGF-β基因克隆到表达载体p ET-SUMO中,IPTG诱导表达后,对表达的融合蛋白SUMO-h NGF-β包涵体进行亲和纯化,然后在变性条件下加入羟胺进行裂解,利用SUMO分子伴侣的功能与h NGF-β进行共复性,最后利用阳离子交换层析纯化获得重组h NGF-β。结果:融合蛋白SUMO-h NGF-β相对分子质量为39×103,表达量占细菌总蛋白的35%;在变性条件下经羟胺切割、共复性和阳离子纯化后,相对分子质量为14×103的重组h NGF-β复性率和纯度分别为30%和80%以上,Western印迹显示其具有良好的抗原特性。结论:h NGF-β与SUMO融合可以在原核表达系统中实现优势表达。

人神经生长因子β亚基cDNA的克隆及序列分析

目的：对国人神经生长因子β亚基（βＮＧＦ）ｃＤＮＡ 进行克隆及序列分析，为研究βＮＧＦ 的生理功能及其在临床应用提供基础与手段。方法：从人海马组织分离，纯化总ＲＮＡ，直接进行逆转录，用ＰＣＲ 扩增βＮＧＦ 的ｃＤＮＡ 得到６５０ｂｐ 的ＤＮＡ 片段，利用Ｔ－ Ａ 克隆载体法，制备重组质粒，克隆βＮＧＦｃＤＮＡ。结果：βＮＧＦ 的ｃＤＮＡ 全序列１０７４ ｂｐ ，其蛋白编码为６３０ ｂｐ ，由２１２ 个氨基酸组成，Ｎ 端为信号肽，中间区为前肽，Ｃ 端为成熟肽。结论：国人βＮＧＦ 序列分析结果与ｇｅｎｅ ｂａｎｋ 中的βＮＧＦ 序列完全一致。

乏氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子C及CD44v6在食管鳞癌中的表达及其临床意义

目的探讨食管鳞状细胞癌(ESCC)中乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)和CD44v6蛋白的表达情况及其与食管癌临床病理特征的关系。方法选择58例ESCC患者,取其手术标本或胃镜活检病理组织,采用免疫组织化学SP法检测ESCC组织中HIF-1α、VEGF-C和CD44v6蛋白的表达。结果 58例患者的ESCC组织中,HIF-1α、VEGF-C和CD44v6均呈高表达,阳性表达率分别为51.7%、53.4%和60.3%。不同性别、临床分期、分化程度的患者,其ESCC组织中HIF-1α、VEGF-C和CD44v6的阳性表达率间差异无统计学意义(P>0.05),而淋巴结转移者ESCC组织中VEGF-C和CD44v6的阳性表达率显著高于无淋巴结转移者,差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α表达与VEGF-C表达呈相关(P<0.05)。结论 VEGF-C、CD44v6表达与淋巴结转移有关,检测二者可作为判定ESCC侵袭转移能力的客观指标,而HIF-1α表达在食管癌淋巴结转移中的作用尚待进一步扩大样本验证。

血清缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子水平与急性冠状动脉综合征的关系

目的研究冠心病(CHD)患者血清低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)水平变化的意义及其与冠状动脉病变支数和狭窄程度的关系。方法选择79例CHD患者,分为急性冠状动脉综合征(ACS)组42例,其中急性心肌梗死(AMI)组23例,不稳定型心绞痛(UAP)组19例;稳定型心绞痛(SAP)组37例;另选35例作为健康对照组。应用酶联免疫吸附测定法测定所有患者HIF-1α、VEGF水平。结果AMI组、UAP组HIF-1α和VEGF水平明显高于SAP组和对照组,HIF-1α(117.6±28.6)pg/L、(110.2±17.1)pg/L vs(49.9±20.5)pg/L、(43.1±16.3)pg/L,VEGF(215.0±51.5)ng/L、(194.4±38.4)ng/L vs(94.3±34.2)ng/L、(90.3±32.9)ng/L(均P<0.01);SAP组VEGF、HIF-1α水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。单支、双支、3支血管病变CHD患者血清HIF-1α、VEGF浓度比较差异无统计学意义(P>0.05)。AMI组、UAP组、SAP组之间Gensini评分差异无统计学意义(P>0.05)。血清HIF-1α、VEGF浓度与Gensini评分之间无相关性。结论HIF-1α、VEGF水平与冠状动脉病变的支数和狭窄程度无关,而与动脉粥样硬化斑块失稳定有关,可能是斑块的不稳定的标志。

核因子-κBp65、缺氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子在变应性鼻炎小鼠鼻黏膜中的表达

目的探讨核因子-κB p65(nuclear factor-κBp65,NF-κB p65)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia induciblefactor 1α,HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)在变应性鼻炎(AR)小鼠鼻黏膜中的表达及其相关性研究。方法 30只FVB系小鼠随机分为对照组、AR组及激素干预组,AR组采用腹腔注射卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏,滴鼻局部激发OVA悬液制备模型。对照组以生理盐水代替OVA,激素干预组每次激发前地塞米松腹腔注射干预。鼻黏膜采用HE染色和免疫组化染色,观察形态学改变和NF-κBp65、HIF-1α及VEGF的表达情况。结果 NF-κB p65、HIF-1α及VEGF在小鼠鼻黏膜的表达是一致的,AR组均较对照组和激素干预组显著增加,差异有显著性(F分别为13.22、16.79、11.84,P均<0.05)。经相关性分析,在AR组中,NF-κBp65与HIF-1α的表达呈正相(r=0.655,P<0.05),HIF-1α与VEGF的表达也呈正相关(r=0.698,P<0.05)。结论在炎症、低氧等刺激下,活化的NF-κB p65通过调控HIF-1α的表达上调VEGF的表达,促进小鼠过敏性气道炎症的发生。

不同类型环氧化酶2抑制剂对椎间盘退变模型大鼠缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子表达的影响研究

目的探讨不同类型环氧化酶2(COX-2)抑制剂对椎间盘退变模型大鼠缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,为椎间盘退变的治疗提供参考。方法选择12月龄SPF级SD大鼠60只,建立椎间盘退变模型后采用简单随机法分为4组,每组15只:对照组采用安慰剂10 mg.kg-1.d-1灌胃给药;塞来昔布组采用塞来昔布胶囊10 mg.kg-1.d-1灌胃给药,尼美舒利组采用尼美舒利颗粒10 mg.kg-1.d-1灌胃给药,双药组采用塞来昔布胶囊5 mg.kg-1.d-1和尼美舒利颗粒5 mg.kg-1.d-1灌胃给药;共饲喂8周。检测各组大鼠HIF-1α和VEGF表达情况,椎间盘组织蛋白多糖的水平,计算软骨细胞凋亡指数(AI)。结果对照组大鼠HIF-1α和VEGF均呈阴性表达,其他各组均呈阳性表达;各组大鼠HIF-1α、VEGF阳性表达情况比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠蛋白多糖水平、AI比较,差异亦均有统计学意义(P<0.05)。结论不同类型COX-2抑制剂塞来昔布和尼美舒利可抑制HIF-1α和VEGF的表达,增加椎间盘组织蛋白多糖水平,降低AI,联合应用效果更明显,可能在椎间盘退变过程中发挥着重要作用。

骨桥蛋白、血管内皮生长因子-A和乏氧诱导因子-1α在肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨骨桥蛋白(OPN)、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)和乏氧诱导因子(HIF)-1α在肝细胞癌(HCC)中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学法检测肝癌组(90例)、癌旁肝硬化组(20例)及正常组(15例)中OPN、VEGF-A和HIF-1α的表达。结果 OPN、VEGF-A和HIF-1α在HCC组呈明显高表达,阳性率分别为76.67%(69/90)、71.11%(64/90)和73.33%(66/90)。其中OPN、VEGF-A显著高于癌旁肝硬化组及正常组,HIF-1α在HCC组的表达与肝硬化组无差异,与正常组有显著差异。OPN、VEGF-A、HIF-1α的表达与肝癌的临床病理特征如癌栓形成、包膜完整性、肿瘤分化和分期、肿瘤转移等有相关性(P<0.05),三者之间表达呈正相关性(P<0.05)。结论 OPN、VEGF-A、HIF-1α在肝癌中高表达,联合检测有助于判断肝癌的生物学特征,为肝癌的分子靶向治疗提供重要的可能靶点。

人胰岛素样生长因子1受体β结构域蛋白的原核表达及活性检测

目的构建人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)β亚基胞外结构域(ED)和胞内激酶(PKD)结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法用PCR方法从乳腺cDNA文库中扩增IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体。重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用Western blot法检测融合蛋白表达,最后用GST pull-down技术检测纯化蛋白与已知蛋白表皮生长因子受体2驱动的细胞运动调节蛋白(MEMO)的相互作用。结果构建得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序后与目的序列一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,并经过Western blot检测,融合蛋白成功表达;纯化得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD两个融合蛋白,GST pull-down证明蛋白GST-IGF1Rβ-PKD可以和MEMO相互作用。结论成功克隆GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因,并获得活性良好的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD蛋白。

PES1在卵巢癌中的表达及其对内皮生长因子的影响

目的探讨PES1在卵巢癌中的表达及其与血管内皮生长因子(VEGF)表达的关系。方法用蛋白印迹法检测PES1在卵巢癌组织以及相应的癌旁组织中的表达。结果肿瘤组织中PES1的表达水平明显高于相应的癌旁组织。转染FLAG-PES1的CAOV-3和ES-2细胞培养液的VEGF分泌量分别由(178.0±11.8)pg/mL和(309.5±18.5)pg/mL上升到(375.0±18.3)pg/mL和(633.2±25.7)pg/mL,VEGF分泌量明显升高(P<0.01);而且VEGF相对mRNA水平也分别上升了约1.8倍和2倍(P<0.01);蛋白印迹法结果表明,PES1过表达能升高这2种细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达。荧光素酶报告基因的转录激活活性检测表明,PES1对调节VEGF的转录没有直接影响。将HIF-1αSiRNA与FLAG-PES1共转染CAOV-3和ES-2细胞后,蛋白印迹法结果表明,HIF-1αSiRNA能明显抑制PES1引起的HIF-1α升高,同时VEGF的分泌量和mRNA水平也被明显抑制。结论 PES1在卵巢癌组织中表达明显升高。

缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子在骨肉瘤组织中的表达及其与血管生成的关系

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)在骨肉瘤组织中的表达及其与血管生成的关系。方法应用免疫组织化学(SP)法,检测35例骨肉瘤、14例骨软骨瘤中HIF-1α、VEGF的表达情况,同时用CD34标记血管内皮细胞,计算微血管密度(MVD)。结果 HIF-1α蛋白染色主要表达于细胞核,在骨肉瘤中阳性表达率高于在骨软骨瘤中阳性表达率(P<0.05)。VEGF蛋白染色主要表达于细胞质及细胞膜,在骨肉瘤中阳性表达率高于在骨软骨瘤中阳性表达率(P<0.05)。Ⅲ期骨肉瘤的HIF-1α、VEGF蛋白的表达强度与Ⅱa期、Ⅱb期比较差异有统计学意义(P<0.05),而Ⅱa期与Ⅱb期的表达强度比较差异无统计学意义(P>0.05)。35例骨肉瘤标本中有14例(40.0%)HIF-1α和VEGF的表达同时呈阳性,13例(37.1%)HIF-1α和VEGF的表达同时呈阴性,8例(22.9%)HIF-1α和VEGF的表达呈不一致性。HIF-1α和VEGF在骨肉瘤中的表达呈正相关。HIF-1α(+)、VEGF(+)的MVD值均显著高于HIF-1α(-)、VEGF(-)(P<0.01)。结论 HIF-1α和VEGF在骨肉瘤组织中均为高表达,提示它们可能在骨肉瘤新生血管生成中具有协同作用,对骨肉瘤的发生、发展起到重要作用。

人胃腺癌中缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子、生存素表达及意义

目的探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）、生存素（Survivin）表达在胃腺癌发生、发展中的作用以及相互关系。方法应用免疫组化（SABC）法检测71例胃腺癌组织及20例正常胃黏膜组织中HIF-1α、VEGF、Survivin的表达情况，并分析其与胃腺癌临床病理特征的关系。结果HIF-1α、VEGF、Survivin在胃腺癌组织中阳性表达率分别为59．15％（42／71）、53．52％（38／71）、47．89％（34／71），而在正常胃黏膜组织中表达不明显或不表达，两者比较差异有统计学意义（P〈0．01），HIF-1α、VEGF及Survivin表达与胃腺癌组织学分级、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期均密切相关（P〈0．05或〈0．01）。胃腺癌组织中HIF-1α表达与VEGF及Survivin表达均呈显著正相关，VEGF与Survivin表达亦呈显著正相关。结论HIF-1α通过上调VEGF及Survivin表达促进胃腺癌发生、发展；VEGF与Survivin间存在协同作用。

脂多糖对小胶质细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的探讨脂多糖(LPS)是否能够通过低氧诱导因子-1α(HIF-1α)调节小胶质细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达。方法培养BV2小胶质细胞系,分为4组:对照组、LPS(100μg/L)刺激组、LRS干预组(LPS 100μg/L及脂多糖拮抗剂200μg/L),HIF-1α抑制剂干预组(LPS 100μg/L及FM19G11 10 mmol/L)。分别采用免疫荧光、West-ern blot、ELISA检测VEGF和HIF-1α的表达情况。结果与对照组比较,LPS可显著增加BV2细胞VEGF表达,脂多糖拮抗剂可明显抑制LPS的这一作用。HIF-1α的表达在LPS刺激8 h后明显增加。HIF-1α抑制剂FM19G11可减少LPS引起的BV2细胞VEGF表达增加。结论 LPS促进小胶质细胞VEGF的表达,HIF-1α参与这一调节过程。

神经生长因子(NGF)对周围神经损伤修复的影响

神经生长因子由Bucker于1948年在实验中偶然发现,Levi-Montalcini用同样方法重复了Bucker的实验,于1952年将NGF的发现公布于世,由于在神经生物学的研究中的重要性,以后许多实验室开始对NGF进行了更深入的研究。目前对NGF的结构、生物活性、作用机制等的认识已有较大进展。

莲草直胸跳甲胰岛素样生长因子系统相关基因IGFALS和IMP3的表达模式

莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila是恶性入侵杂草空心莲子草Alternanthera philoxeroides的专食性天敌。为阐明该跳甲生殖调控的分子机制,筛选其卵巢转录组数据得到3个胰岛素样生长因子系统相关基因,分别为胰岛素样生长因子酸不稳定亚基(IGFALS)和其亚型X1 (IGFALS X1)以及胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3 (IMP3),利用半定量PCR方法检测3个基因在雌成虫不同发育时期的表达模式,并通过荧光定量PCR技术检测其在不同组织及不同发育时期的表达水平。结果显示,筛选到的IGFALS、IGFALS X1和IMP3基因在莲草直胸跳甲蛹期和成虫期均有表达,且3个基因在蛹期和成虫期均为全身性表达,IGFALS和IMP3 mRNA在成虫卵巢组织中表达量显著高于其他组织,峰值分别出现在成虫羽化后第5天和第1天,较蛹期第1天分别增加了3.56和3.81倍,因此推测IGFALS和IMP3基因在莲草直胸跳甲卵子发生过程中发挥重要的调控作用。

聚焦超声治疗对外阴低级别鳞状上皮内病变模型大鼠外阴皮肤缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子及突变型p53表达的影响

目的探讨聚焦超声治疗对外阴低级别鳞状上皮内病变(LSIL)模型大鼠外阴皮肤中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)及突变型p53(mtp53)表达的影响。方法建立28只外阴LSIL大鼠模型,随机分为治疗组(n=14)及对照组(n=14)。治疗组予以聚焦超声辐照,对照组予超声假辐照(治疗仪无功率输出)。4周后取模型大鼠外阴皮肤行组织病理学观察,并以免疫组织化学方法检测HIF-1α、VEGF及mtp53表达。结果聚焦超声辐照/假照后4周治疗组92.86%(13/14)外阴皮肤基本恢复正常生理结构,对照组71.43%(10/14)进展为高级别鳞状上皮内病变(HSIL)。治疗组大鼠外阴皮肤中HIF-1α、VEGF及mtp53表达均明显低于对照组(P均<0.05)。结论聚焦超声可通过降低HIF-1α、VEGF及mtp53表达,改善局部组织微环境而安全、有效治疗大鼠外阴LSIL。

子宫内膜癌组织中缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子表达的临床意义

目的探讨缺氧与子宫内膜癌发生、发展的关系。方法运用免疫组织化学技术检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)在正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜及子宫内膜癌组织中的表达。结果 HIF-1α(73.21%,25.64%,4.88%)和VEGF(78.51%,30.77%,7.32%)在子宫内膜癌组织中、不典型增生子宫内膜和正常子宫内膜中的表达率差异有统计学意义(P<0.05);HIF-1α和VEGF的表达存在正相关性;HIF-1α和VEGF的表达与子宫内膜癌的浸润深度、淋巴结转移及临床分期密切相关,VEGF的表达还与子宫内膜癌的病理分级密切相关。结论 HIF-lα和VEGF的高表达对于子宫内膜癌的发生起着重要作用,并可能与其恶性进展密切相关。

胰岛素样生长因子-1对氯化钴诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对氯化钴(CoCl_2)诱导的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的作用及机制。方法取对数生长期的PC12细胞,分别以10、20、40、80μmol/L的CoCl_2溶液和100、200、400μg/L的IGF-1溶液处理细胞,CCK-8法检测细胞活力,得出CoCl_2和IGF-1最佳干预浓度。根据选定的实验条件,应用CoCl_2处理PC12细胞建立HIE细胞模型,实验分为对照组、CoCl_2处理组、IGF-1+CoCl_2处理组。分组处理24 h后采用CCK-8法检测细胞存活率;TUNEL染色检测细胞凋亡情况;Western blot检测各组细胞Bax、Bcl-2及Caspase-3的蛋白的表达水平。最后在上述实验的基础上,设CoCl_2处理组、CoCl_2+IGF-1处理组、HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2-MeOE2)+CoCl_2组和CoCl_2+2-MeOE2+IGF-1组,Western blot观察IGF-1、2-MeOE2及两者共用对PC12细胞HIF-1α及Bax的表达水平的影响。结果 CCK-8检测结果显示,40μmol/L CoCl_2和200μg/L IGF-1为最佳干预浓度。利用以上浓度分组干预细胞24 h后,与CoCl_2组相比,IGF-1+CoCl_2处理组细胞存活率明显提升,TUNEL阳性细胞数和细胞比例降低,同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调,促凋亡蛋白Bax、Caspase-3,HIF-1α表达下调,差异均有统计学意义(均P<0.05)。应用2-MeOE2对细胞进行预处理后,CoCl_2+2-MeOE2组与2-MeOE2+IFG-1组HIF-1α和Bax蛋白表达差异无统计学意义,但均较CoCl_2+IGF-1组明显下调(P<0.01)。结论 IGF-1可抑制CoCl_2诱导的PC12细胞凋亡,其保护作用可能与HIF-1α表达下调有关。