应用全内反射单分子荧光成像研究蛋白复合物亚基组成

细胞的生化过程大都是由蛋白复合物完成的,研究蛋白复合物亚基的组成对于了解蛋白质的结构和生物学功能具有重要的意义,然而如何准确确定蛋白复合物中蛋白质亚基的数量(stoichiometry)仍然是一个挑战.近年来,活细胞体系单分子荧光成像技术的不断发展为原位实时动态地研究蛋白质的结构和性质提供了新的手段.本文主要介绍了应用活细胞全内反射单分子荧光成像技术表征细胞膜区蛋白复合物组成的3种方法,包括单分子漂白步数分析、荧光强度统计分布以及蛋白运动分析,并结合其基本原理介绍了这几种方法在活细胞体系膜蛋白研究中的应用.

拉直的单个DNA分子的全内反射荧光实时成像研究

全内反射荧光(TIRF)成像技术利用穿透深度仅200nm左右的隐失波来激发诱导荧光,探测灵敏度和图像信噪比大大提高,成为单分子研究的有力工具。分子梳技术利用DNA末端与固体表面的结合力和周围流体流动产生的侧向力将DNA分子拉伸并平铺在表面上。结合这两种技术,对分子梳拉直的单个DNA分子进行了清晰的实时荧光成像,发现TIRF成像条件下DNA分子与荧光探针YOYO-1组成的复合体可自然避免发生光敏断裂现象;实时监测了单个DNA-YOYO-1复合体的光漂白过程,通过对激发光照射时间与探测器曝光时间进行同步控制,可大幅降低光漂白程度,为拉直的单个DNA分子的长时间实时观察和成像研究优化了实验条件,为实时、可视化地研究其与蛋白质相互作用的动力学过程奠定了基础。

全内反射荧光成像技术及其在单分子检测中的研究进展

全内反射荧光显微镜技术是当今最灵敏的生物成像和检测方法之一,可以直接探测单个荧光分子。这种方法已成功地用于生命科学、化学、物理学等研究领域,获得了常规方法无法得到的重要信息。本文介绍了全内反射荧光显微镜的工作原理和实验技术,总结了近年来这种单分子检测方法在生命科学、化学等领域的重要应用,并对其发展前景进行了展望。

单分子荧光原位杂交(smFISH)技术及应用

单分子荧光原位杂交(single-molecule fluorescence in situ hybridization,smFISH)技术是一种通过用偶联荧光基团的寡核苷酸探针,对固定细胞或组织中单个mRNA分子进行成像的方法。smFISH可对RNA进行定位、定量,以此对目标转录本进行实时研究。sm FISH适用于细胞、组织切片等多种类型生物样本。近年来,多种基于基础smFISH的改进技术被发明,进一步促进了该技术的实际应用。smFISH良好的RNA单分子可视化能力,使得其在发育生物学、神经生物学及肿瘤生物学等基础生物学科中得到了广泛的应用。本文综述了smFISH技术基本原理、smFISH技术的局限性、smFISH衍生技术方法、smFISH在不同生物学科中的应用进展,并对smFISH技术的发展前景做出展望。

大鼠原代脂肪细胞中单个GLUT4囊泡的成像——全内反射荧光显微成像技术的应用

本研究采用高斯拟合算法与全内反射荧光显微技术(TIRFM),通过实时动态的单粒子追踪拍摄来分析原代培养大鼠脂肪细胞基础条件及胰岛素刺激下细胞膜附近绿色荧光蛋白(GFP)标记的GLUT4囊泡的运动变化.使用高斯拟合来消除光学成像系统中发生的原始样品中单像素点荧光强度值的污染,重建出囊泡真实的中心点荧光强度值.通过对序列图像中的囊泡点应用高斯拟合和相应的搜索算法,得到所有囊泡的高斯中心点荧光强度值序列,继而描绘出囊泡的动态转运路径.结果表明,基础条件下膜附近的多数GLUT4囊泡处于沿同一路径的快速长距离转运状态;胰岛素刺激后,长距离转运的GLUT4囊泡数量减少,多数GLUT4囊泡固定成团或者在原地摆动呈限制性的运动.当GLUT4囊泡锚定至膜上后,即迅速与膜融合.说明高斯拟合算法及全内反射荧光显微技术的结合可以很好地实现囊泡纳米尺度的三维实时追踪.

膜片钳技术结合全内反射荧光成像技术在单细胞胞吐活动研究中的应用

介绍了膜片钳和全内反射荧光成像的工作原理、实验技术,以及这两种技术的结合在单细胞胞吐研究中的应用,并对其发展前景进行了展望。

全内反射荧光技术在病毒成像中的应用和比较

目的:建立以激光为光源的全内反射荧光技术在活体病毒观察示踪的新方法。方法:分别使用普通荧光,激光共聚焦和全内反射荧光显微镜拍摄非洲绿猴肾上皮细胞上的人偏肺病毒,并对图像进行比较。结果:TIRF成像分辨率和时间分辨率上均优于传统荧光以及激光共聚焦,但只能观察到邻近培养介质的病毒,使用条件受到一定的限制。结论:全内反射荧光显微技术可以用于病毒成像,为研究病毒、细菌等病原微生物感染机制提供了直观有效的技术手段。

偏振光激发的单分子荧光纵向成像研究

本文从单分子的水平上,详细分析并模拟了不同偏振光下的单个荧光分子的成像,指出荧光成像强度的差别是由分子的纵向位置及跃迁偶极矩的取向共同决定的。给出了确定荧光分子偶极矩取向的方法,并在此基础上给出了重构分子间纵向间隔的公式。

单分子定位超分辨显微成像有机荧光探针的研究进展

在生物医学领域,对纳米尺寸级别的微小生物目标进行精确定位研究具有非常重要的意义,而光学显微成像技术为此提供了强有力的工具。光学显微成像技术受到光学衍射极限的限制,难以分辨尺寸在衍射极限(<200 nm)以下的生物结构,无法直接获取微小生物结构信息,阻碍了生物医学的进一步发展。近年来,随着纳米分辨显微成像技术的出现,新型荧光探针的开发、成像系统与设备的不断发展及成像算法不断完善地深入结合,促进了光学衍射极限以下尺寸微观目标的研究。基于单分子定位的超分辨荧光显微成像(SMLM)包括光激活定位成像(PALM)与随机光学重构超分辨成像(STORM),将有机荧光探针与超分辨光学显微成像技术紧密结合在一起,荧光探针的光物理性质直接决定着超分辨成像结果的好坏。因此,设计不同性能的荧光探针可以实现超精细结构的不同超分辨成像,为研究其生物学功能提供了有力的工具。本文着重围绕基于SMLM的原理、有机荧光探针的设计要求、用于SMLM的荧光探针种类及其生物应用等方面进行总结综述,指出了单分子定位成像上存在的不足,并对其发展方向进行了展望,希望为对超分辨成像研究感兴趣或初涉该领域的研究者提供成像理论与探针设计方面的帮助。

单分子荧光成像技术下的运动员疲劳程度检测

无接触环境下对运动员疲劳程度进行检测是一项新型技术,提出基于单分子荧光成像技术的运动员疲劳程度检测方法,通过单分子荧光成像装置,获取运动员身体机能荧光信号,并计算荧光寿命数值,获取运动员心率、血氧饱和度、体温、运动能耗在不同运动强度下的变动值。将这4种身体机能荧光寿命变动值参数,带入BP神经网络模型进行迭代训练检测,获取运动员疲劳程度检测结果。实验结果显示,当20位运动员在8 km/h的长跑速度下,运动160 min后,其4种生理荧光寿命均逐渐变大,疲劳程度从10.55%提升至80.44%。经计算,该方法检测结果均方根误差较小,在50 dB背景噪声下,检测结果差值不超出所设定的允许误差范围。

全内反射荧光显微术

全内反射荧光显微技术是当今世界上最具前途的新型生物光学显微技术之一 ,可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。它利用全内反射产生的隐失波照明样品 ,使照明区域限定在样品表面的一薄层范围内 ,因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比和对比度。近年来 ,已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。本文系统的介绍了全内反射荧光显微技术的原理、国内外的发展和现状及其在生物学上的应用 ,并对其未来做了展望。

单分子定位超分辨显微成像技术研究进展及展望(特邀综述)

随着新型荧光探针、先进激光、高灵敏光电探测器等相关领域的不断发展,突破衍射极限的超分辨光学显微技术为现代生物医学研究提供了新的有力工具,其中的单分子定位技术利用荧光分子的光开关效应,实现了亚细胞结构的纳米精度超分辨成像.本文介绍了单分子定位超分辨显微技术的基本原理与实现,例举了其在细胞生物学、组织生物学以及神经科学等方面的应用,讨论了该技术目前的发展趋势及可能的改进方向,为相关领域科学研究提供参考.超分辨光学显微技术的不断创新将推动生命科学的新发展.

全内反射荧光显微术原理及其应用

全内反射荧光显微术,利用全内反射时产生的隐失波照明样本,仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团,与传统的荧光显微镜相比,使显微成像在Z轴上的空间分辨率得到了显著改善,大大提高了图像的信噪比和对比度。近年来,该技术已被生物学家们广泛地应用于单分子荧光成像中。本文介绍了全内反射荧光显微术的原理及其在生物学研究中的应用,并对其未来发展前景作了展望。

一种高精度的荧光单分子纳米级定位算法

荧光成像系统的技术指标、采集的荧光图像信噪比和单分子定位算法是影响单分子定位精度的3大因素.在介绍单分子定位的基本极限精度和理论计算精度的基础上,提出了一种被称为图像去噪高斯掩膜算法的单分子定位算法.依据实验用单分子成像系统的具体配置,通过计算机仿真表明,该算法良好的去噪处理和高斯加权质心运算方式,不仅能实现纳米级的定位精度,而且能突破一般理论计算精度的限制,接近基本极限精度,特别是在背景噪声较大的情况下,其优势更加明显.这对单分子的精确定位和跟踪、扩散方式分析、转移速率计算等具有重要的意义.

单分子成像和追踪技术在工业微生物研究中的应用

在单分子工具和技术的迅速发展过程中,单分子荧光显微镜技术脱颖而出,可以高特异性地监测荧光标记的生物分子的时空行为,成为研究生物系统的有力工具。然而,单分子成像和追踪技术在工业微生物研究及酶工程领域中的应用仍处于起步阶段。随着生物工程技术、合成生物学和代谢工程等科学技术的迅猛发展,工业微生物的应用日趋广泛。但是,菌株往往难以在整个培养期间保持最大的生产能力,导致在经济效益上不能满足产业化的需求,成为制约微生物细胞工厂发展的一个瓶颈,对酶学研究提出新的挑战。单分子成像和追踪技术具有直接、准确、实时等监测优点,可以直接在活体生物上进行研究,成功地实现了对单分子酶催化过程的实时监控,发现了多种酶的新单分子行为及反应机制。这些技术有助于各种新型酶、新特性酶、新作用方式酶的研发。本文简述单分子成像和追踪技术的主要特点(以荧光显微镜为主),总结近年来单分子成像和追踪技术在微生物研究、酶学研究中的应用,及其在工业微生物研究中的应用现状和面临的挑战。这些技术的应用必将促进纳米生物学的发展,推动酶工程改造,提高细胞工厂的生产能力。

生物单分子探测与成像的新进展

生物单分子研究是分子生物学向更深层次发展的自然趋势。从上世纪末开始,由于研究单分子技术的不断发展,这一领域已取得了许多重要成果。近年来活细胞内单分子过程的揭示成为关注的焦点。文章仅从基因表达的研究、用受激发射损耗(STED)成像研究细胞膜、胞浆中单个分子的追踪以及单分子力谱在细胞生物学中的应用等几个方面说明本领域发展的现状。

单分子免疫检测系统的光学系统设计

单分子免疫检测,是指将免疫复合物限制在极小的体积内,对产生的信号进行计数,是一种“数字化”的免疫检测技术。单分子免疫检测仪的核心类似于一个荧光显微系统,但普通的荧光显微镜结构复杂,且与生物芯片规格无法匹配,不能很好地满足检测需求。针对自行研制的生物芯片规格,合计了一套高性能的单分子免疫检测光学系统。根据设计要求,确定了合适的初始结构;在荧光显微系统原理和像差分析理论的基础上,使用光学设计软件Zemax对系统进行反复优化设计;设计出了满足单分子免疫检测成像要求的光学系统。系统的成像部分由15片折射透镜组成,工作距离为4mm,放大倍率为-4.52,调制传递函数值在奈奎斯特频率73lp/mm处均大于0.44,畸变为0.8%,照明部分采用柯勒照明方式,在整个视场范围内,物面上的照度均匀度达到97%。整个系统采用国产常规玻璃,有利于加工和降低成本。经优化后的高分辨率荧光显微系统结合当前发展成熟的全自动化检测技术,可以极大提高单分子免疫检测的检测灵敏度和准确率。

基于单分子成像技术研究λ-DNA分子穿越微米通道端口的电动力学特性

操控单个DNA分子,将其有效引入、导出微纳通道是实现DNA生物芯片功能的前提条件.本文利用单分子荧光显微成像技术系统地实时观察分析λ-DNA单分子在电场力驱动下进入/穿出50μm通道端口处的电动力学特性及规律.研究发现:λ-DNA分子能够顺利进入trans端口并穿出cis端口,外加电场强度存在最大(Emax)和最小(Emin)阈值,只有场强E满足:Emin≤E≤Emax时, λ-DNA分子才能进入trans端口并顺利穿出cis端口;当电场强度小于最小阈值场强时, DNA分子不能进入trans端口;当电场强度大于最大阈值场强时, λ-DNA分子虽可能从trans端口进入通道内部,但不容易从cis端口穿出,而是在迁移至通道内cis端口附近时,运动方向反转、往复、甚至旋转等新现象,并且易于粘附到管壁上;随着场强增大,反转位置距cis端口越大.基于微流体电动力学理论,对λ-DNA分子在微通道端口的不同运动状态的物理机制进行了初步分析.本研究结果对研制基于微纳通道系统的基因芯片实验室及DNA分子传感器具有一定的实际指导意义.

细胞膜上信号转导蛋白的单分子成像与分析

结合本课题组的研究工作,介绍了单分子荧光成像原理、荧光标记方法及数据分析方法,并进一步综述了单分子荧光成像在几种重要的膜蛋白信号转导分子机制和相关药物研究中的进展.