膜片钳技术结合全内反射荧光成像技术在单细胞胞吐活动研究中的应用

介绍了膜片钳和全内反射荧光成像的工作原理、实验技术,以及这两种技术的结合在单细胞胞吐研究中的应用,并对其发展前景进行了展望。

大鼠原代脂肪细胞中单个GLUT4囊泡的成像——全内反射荧光显微成像技术的应用

本研究采用高斯拟合算法与全内反射荧光显微技术(TIRFM),通过实时动态的单粒子追踪拍摄来分析原代培养大鼠脂肪细胞基础条件及胰岛素刺激下细胞膜附近绿色荧光蛋白(GFP)标记的GLUT4囊泡的运动变化.使用高斯拟合来消除光学成像系统中发生的原始样品中单像素点荧光强度值的污染,重建出囊泡真实的中心点荧光强度值.通过对序列图像中的囊泡点应用高斯拟合和相应的搜索算法,得到所有囊泡的高斯中心点荧光强度值序列,继而描绘出囊泡的动态转运路径.结果表明,基础条件下膜附近的多数GLUT4囊泡处于沿同一路径的快速长距离转运状态;胰岛素刺激后,长距离转运的GLUT4囊泡数量减少,多数GLUT4囊泡固定成团或者在原地摆动呈限制性的运动.当GLUT4囊泡锚定至膜上后,即迅速与膜融合.说明高斯拟合算法及全内反射荧光显微技术的结合可以很好地实现囊泡纳米尺度的三维实时追踪.

全内反射荧光技术在病毒成像中的应用和比较

目的:建立以激光为光源的全内反射荧光技术在活体病毒观察示踪的新方法。方法:分别使用普通荧光,激光共聚焦和全内反射荧光显微镜拍摄非洲绿猴肾上皮细胞上的人偏肺病毒,并对图像进行比较。结果:TIRF成像分辨率和时间分辨率上均优于传统荧光以及激光共聚焦,但只能观察到邻近培养介质的病毒,使用条件受到一定的限制。结论:全内反射荧光显微技术可以用于病毒成像,为研究病毒、细菌等病原微生物感染机制提供了直观有效的技术手段。

全内反射荧光显微技术实时观察人偏肺病毒感染

目的利用显微成像技术拍摄并分析人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)的入胞过程,以探讨hMPV的感染免疫方式。方法使用全内反射荧光技术(total internal reflection fluorescence,TIRF)连续拍摄带有绿色荧光蛋白的病毒影像,并逐帧分析病毒的感染过程。结果感染开始后邻近培养介质的细胞膜上hMPV数量缓慢增多并在15～20 min时大量进入细胞。黏附于细胞上的病毒大部分做小振幅的无规律运动,偶见快速移动。感染12 h后hMPV在细胞膜阴影处、两细胞交界面大量聚集。结论本研究探讨了使用TIRF实时观察病毒入胞的可行性,结果表明TIRF技术能够连续观察病毒的运动规律和分布状况,为进一步揭示hMPV的感染免疫机制以及疫苗研制奠定了实验基础。

全内反射荧光显微术

全内反射荧光显微技术是当今世界上最具前途的新型生物光学显微技术之一 ,可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。它利用全内反射产生的隐失波照明样品 ,使照明区域限定在样品表面的一薄层范围内 ,因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比和对比度。近年来 ,已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。本文系统的介绍了全内反射荧光显微技术的原理、国内外的发展和现状及其在生物学上的应用 ,并对其未来做了展望。

红外光谱法与荧光光谱成像技术结合神经网络对正毛化橘红的快速鉴别

为探究一种快速、可靠的化橘红检测方法,本实验分别采用傅里叶变换衰减全反射红外光谱法和荧光光谱成像技术结合多层感知器（MLP）神经网络所构建的模式识别方法,对化橘红进行鉴别,并对两种方法进行了比较。实验以81个正毛化橘红,37个其他品种橘红共118个样品为研究对象,采集所有样品的红外光谱和荧光光谱图像。根据光谱曲线中不同样品间的差异,取红外光谱中550-1800cm^-1区段范围内的光谱数据和荧光光谱曲线中的400~720nm区段的光谱数据进行分析,应用主成分分析法（PCA）对化橘红的光谱数据进行降维处理,再结合MLP神经网络对化橘红样品进行判别分析。实验中分别使用多元散射校正（MSC）、标准正态变量校正（SNV）、一阶导（FD）、二阶导（SD）以及Savitzky-Golay（SG）平滑数据预处理方法,并比较他们对鉴别模型的影响。分析结果表明：利用红外光谱法（FTIR/ATR）,经由Savitzky-Golay（SG）平滑预处理得到的数据,通过隐层函数为sigmoid的三层MLP模型,能够得到最优正毛化橘红识别率,其结果训练集和测试集的识别率都为100%;利用荧光光谱成像技术,由多元散射（MSC）预处理的结果是最理想的。经过预处理的数据,通过隐层函数为sigmoid函数的三层MLP模型,训练集识别率达到100%,测试集识别率达到96.7%。由此可见,衰减全反射红外光谱法（FTIR/ATR）和荧光光谱成像技术分别与MLP神经网络构建的识别模式,均可对化橘红的判别达到快速、可靠的效果。

全内反射荧光显微术原理及其应用

全内反射荧光显微术,利用全内反射时产生的隐失波照明样本,仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团,与传统的荧光显微镜相比,使显微成像在Z轴上的空间分辨率得到了显著改善,大大提高了图像的信噪比和对比度。近年来,该技术已被生物学家们广泛地应用于单分子荧光成像中。本文介绍了全内反射荧光显微术的原理及其在生物学研究中的应用,并对其未来发展前景作了展望。

浅谈全内反射荧光显微术在DNA复制研究中的应用

传统生物学方法的研究结果来自于集群平均,但生物化学反应是一个动态的过程,因此反应过程中很多瞬时的中间过程往往被传统的生物学研究方法所忽略。单分子技术在生物学中的应用,使得对反应过程进行实时观测成为了可能。本文以全内反射荧光显微术在DNA复制研究中的应用为例,来探讨单分子技术在生物学研究中的重要作用。

空间分辨荧光分析技术

空间分辨荧光分析技术突破了传统荧光分析的局限 ,为获得空间定位信息提供了技术保障。系统地综述了构成该技术的共焦荧光法、全内反射荧光法、多光子荧光法以及近场荧光法等 4种方法的原理、特点、发展及其应用 ,并且强调了其在单分子测定中的作用。引用文献 6 4篇。

光学技术在细胞成像中的应用

本文对光学技术在细胞成像方面的应用进行了综述。着重介绍了激光扫描共聚焦显微镜、多光子荧光成像技术、全内反射荧光显微镜、近场扫描光学显微成像技术、光学相干层析成像技术的基本原理及其主要特点。体现了光学检测技术无侵入、无电离辐射,具有多种操作模式,可获得实时与定量等多种信息的特点,在生命科学研究中具有举足轻重的地位。

力学信号介导的抗原受体的免疫活化初探

目的B淋巴细胞具有机械力感知功能,通过其表面表达的B细胞受体(BCR)识别抗原的理化特性。然而,BCR感知机械力的灵敏度及其活化机制仍然未知。方法使用机械力探针(TGT)系统,在其机械力范围内(12~56 p N)对B细胞进行研究,力图解决这一问题。实验中,利用全内反射荧光显微镜(TIRFM)成像系统,观察到的幼稚B细胞表达的Ig M型BCR的活化呈现对机械力敏感的活化趋势。结果和结论Ig M型BCR在较低机械力(12~16 p N)下会引发较弱的激活,23-43 p N机械力会启动中等程度的活化,而较高机械力(50~56 p N)产生的较强的激活,整体呈现一个明显的多阈值效应。对其机制进行研究,发现Ig M型BCR在高机械力阈值而非中级或较低的机械力阈值的活化,部分依赖于肌球蛋白IIA。最令惊奇的是,记忆性B细胞表达的Ig G型BCR,只需要小于12 p N的极低阈值便可活化,这为抗原刺激后细胞迅速的免疫应答提供了另一种解释。一系列突变体实验揭示Ig G型BCR的重链胞内区对其仅需非常小的机械力便可活化的特性而言,是充分且必要的。这些结果说明不同亚型的BCR对机械力的灵敏度和活化阈值是不同的。这些研究将为B细胞受体活化,记忆B细胞快速应答反应、疫苗设计和药物开发等方面提供初步的理论指导。

原子力显微技术与其他生物技术的联用

原子力显微技术(AFM)是一种高分辨率显微成像系统,与其他生物技术联用,使AFM在充分发挥自身优势的同时,建立新的研究方法,扩大其应用范围,是未来发展的重要方向。简要综述了AFM与其他显微技术、计算机模拟技术、蛋白质工程技术和质谱技术等联用的进展。

应用全内反射单分子荧光成像研究蛋白复合物亚基组成

细胞的生化过程大都是由蛋白复合物完成的,研究蛋白复合物亚基的组成对于了解蛋白质的结构和生物学功能具有重要的意义,然而如何准确确定蛋白复合物中蛋白质亚基的数量(stoichiometry)仍然是一个挑战.近年来,活细胞体系单分子荧光成像技术的不断发展为原位实时动态地研究蛋白质的结构和性质提供了新的手段.本文主要介绍了应用活细胞全内反射单分子荧光成像技术表征细胞膜区蛋白复合物组成的3种方法,包括单分子漂白步数分析、荧光强度统计分布以及蛋白运动分析,并结合其基本原理介绍了这几种方法在活细胞体系膜蛋白研究中的应用.

细胞膜上信号转导蛋白的单分子成像与分析

结合本课题组的研究工作,介绍了单分子荧光成像原理、荧光标记方法及数据分析方法,并进一步综述了单分子荧光成像在几种重要的膜蛋白信号转导分子机制和相关药物研究中的进展.

单分子技术在G蛋白偶联受体二聚体中的应用

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)不仅能以单体的形式发挥生物学作用,还可以相互作用形成同源/异源二聚体,后者是调节受体功能的一种重要方式,能改变下游信号蛋白的偶联,产生特异信号转导通路,介导一系列生理和病理过程,如心血管调节、能量代谢等。因此,GPCR二聚体成为新型药物靶点之一,备受关注。但是以往对GPCR二聚体的研究一直是按总体平均水平(ensemble average)进行,这隐藏了有价值的信息,失去了生物异质性的有用数据。单分子技术具有前所未有的时空分辨率,能够直接显示GPCR二聚体的内部状态、运动轨迹,以及随着时间和周围环境的变化而转变等,有助于进一步剖析GPCR二聚体的关键作用和相关药物的开发。因此,该文将对研究GPCR二聚体的单分子技术(如全内反射荧光显微镜、受激发射损耗显微技术、基态耗尽显微术等)进行简要综述。

隐失驻波全内反射荧光显微术的数值计算

从理论上详细计算了在全内反射的条件下 ,两束入射光产生的隐失干涉场 (即隐失驻波 )的强度分布 ,并分析了其不同于传统传播波干涉场的特点。同时使用数值模拟证明了利用隐失干涉场 ,即隐失驻波的激发方式 ,可以提高系统的分辨力 ,在横向实现超经典分辨的荧光成像。具体的分析表明 ,两束光以相等的角度入射 ,同时振幅相等 ,偏振态相同 ,所形成干涉条纹的反衬度最高 ,此时成像系统的有效点扩展函数最优化 ;入射介质 1的折射率越大 ,隐失干涉场的空间周期越短 (空间频率越高 ) ,其对应的调制点扩展函数中心瓣的半峰全宽越小 ,可能分辨更小的物体 ,但同时旁瓣的强度也增强 。

中国书画文物研究中的自动高光谱扫描系统应用

中国书画是一种绘制在纸或绢上的绘画形式,具有多种绘画风格和绘制技法。为了无损分析中国书画,研究绘制技法,研制了一套由高光谱相机、卤素光源、自动扫描平台、数据处理软件和数据库组成的自动高光谱扫描系统。使用自动高光谱扫描系统和X射线荧光面扫描技术无损分析了两幅重要的中国书画。在分析过程中,不仅提取了底稿线信息,而且鉴别了颜料的种类,并获得了颜料的相对浓度分布信息,这对于书画绘制工艺和颜料调和工艺的研究具有重要的作用。

紧聚焦径向偏振倏逝场的测量

基于径向偏振光束的全内反射荧光显微成像具有更高的成像分辨率,探究其倏逝场的强度分布规律是实现系统结构设计和优化的关键。基于矢量衍射理论,推导了聚焦的径向偏振倏逝场的数学表达式,进行了理论计算,并基于扫描近场光学显微镜搭建了实验系统,测试了倏逝场的强度分布,验证了理论分析。测试结果表明,聚焦的径向偏振光束产生的倏逝场在横向及轴向都具有非常高的分辨率,在可见光波长范围内,光斑横向半高全宽度在100~200nm范围,轴向半高全宽度在40~80nm范围,突破了衍射极限,证明了该类型倏逝场在全内反射荧光显微成像领域巨大的应用价值,也为接下来的系统改进提供了技术支持。

G蛋白偶联受体寡聚体的研究方法

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs)能以同源或异源二聚体,甚至是高阶寡聚体的形式存在,这些形式有不同于单体的特异功能特征,例如生物合成、配体连接、脱敏、内化和降解,因此成为备受关注的药物设计靶点。而对GPCRs这些寡聚体形式进行药物设计首要的任务是要确定这些受体之间能否形成寡聚体。因此,本文将全面介绍用于研究GPCRs寡聚化的生物化学和生物物理方法。