全内反射荧光显微技术实时观察人偏肺病毒感染

目的利用显微成像技术拍摄并分析人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)的入胞过程,以探讨hMPV的感染免疫方式。方法使用全内反射荧光技术(total internal reflection fluorescence,TIRF)连续拍摄带有绿色荧光蛋白的病毒影像,并逐帧分析病毒的感染过程。结果感染开始后邻近培养介质的细胞膜上hMPV数量缓慢增多并在15～20 min时大量进入细胞。黏附于细胞上的病毒大部分做小振幅的无规律运动,偶见快速移动。感染12 h后hMPV在细胞膜阴影处、两细胞交界面大量聚集。结论本研究探讨了使用TIRF实时观察病毒入胞的可行性,结果表明TIRF技术能够连续观察病毒的运动规律和分布状况,为进一步揭示hMPV的感染免疫机制以及疫苗研制奠定了实验基础。

大鼠原代脂肪细胞中单个GLUT4囊泡的成像——全内反射荧光显微成像技术的应用

本研究采用高斯拟合算法与全内反射荧光显微技术(TIRFM),通过实时动态的单粒子追踪拍摄来分析原代培养大鼠脂肪细胞基础条件及胰岛素刺激下细胞膜附近绿色荧光蛋白(GFP)标记的GLUT4囊泡的运动变化.使用高斯拟合来消除光学成像系统中发生的原始样品中单像素点荧光强度值的污染,重建出囊泡真实的中心点荧光强度值.通过对序列图像中的囊泡点应用高斯拟合和相应的搜索算法,得到所有囊泡的高斯中心点荧光强度值序列,继而描绘出囊泡的动态转运路径.结果表明,基础条件下膜附近的多数GLUT4囊泡处于沿同一路径的快速长距离转运状态;胰岛素刺激后,长距离转运的GLUT4囊泡数量减少,多数GLUT4囊泡固定成团或者在原地摆动呈限制性的运动.当GLUT4囊泡锚定至膜上后,即迅速与膜融合.说明高斯拟合算法及全内反射荧光显微技术的结合可以很好地实现囊泡纳米尺度的三维实时追踪.

膜片钳技术结合全内反射荧光成像技术在单细胞胞吐活动研究中的应用

介绍了膜片钳和全内反射荧光成像的工作原理、实验技术,以及这两种技术的结合在单细胞胞吐研究中的应用,并对其发展前景进行了展望。

线虫荧光标记稳定表达系的建立

目的:建立稳定表达的PHluorin标记的线虫种系,为囊泡在线虫ALA神经元上分泌机制的研究提供模型。方法:采用了国际先进的线虫转基因技术,将构建的Pida-1IDA-1:PHluorin质粒通过显微注射到线虫的母代,通过筛选后得到稳定表达的种系。结果:通过DIC显微镜整体检测和全内反射荧光成像技术(Tirfm)细胞检测,蛋白表达的位置正确,通过高倍数体式显微镜确定稳定种系中阳性率高达99%。结论:建立了一个稳定表达的荧光标记线虫种系,为进一步在线虫上研究囊泡分泌提供了很好的模型。

Rab27对致密核心囊泡分泌调控机制的研究

Rab蛋白是一类属于Ras蛋白超家族的小分子量GTP结合蛋白。Rab家族定位于不同的亚细胞结构并且调控胞内运输的不同阶段。