全外显子测序联合基因组拷贝数变异测序在儿科遗传病诊断中的应用

目的探讨全外显子测序(whole exome sequencing,WES)联合基因组拷贝数变异测序(copy number variation sequencing,CNVseq)在儿科遗传病诊断中的应用价值。方法选取2019年8月至2023年7月郑州市妇幼保健院新生儿科及儿科收治的怀疑患有遗传性疾病或临床诊断不明确的患儿为研究对象,采集患儿及其父母外周血进行WES及CNVseq检测,对检出的变异进行分类及评级,并进行一代测序或qPCR验证。结果共纳入患儿33例,其中男性18例,女性15例,年龄范围为1 d~8岁。WES的阳性检出率为36.4%(12/33),CNVseq阳性检出率为9.1%(3/33),两者联合阳性检出率为45.5%(15/33)。结论WES联合CNVseq是儿童遗传性疾病分子诊断的有力工具,可作为一线检测手段在临床大力推广。

高深度全基因组测序技术的产前应用进展

全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)是一种新兴的基因检测技术,其原理为基于二代测序,使用合适的测序深度对人体基因组进行全范围的测序,分析其遗传信息,有检测类型全面、基因组覆盖度高、测序流程误差少等优点。但由于其检测成本较高、产出数据量大、测序数据分析复杂等特点,在临床中的实际应用仍较少,目前主要针对临床罕见病进行病因探索研究,在产前诊断领域中的应用尚不成熟。由于产前诊断领域对检测技术的准确性和时效性要求较高,产前有对胎儿遗传病进行全面筛查的需求,近年来逐渐有研究尝试在产前诊断领域使用高深度WGS作为诊断方法,以探索其是否有作为产前诊断手段的潜力及优势,本文收集了目前国内外发表的产前WGS队列研究,浅论其在产前诊断中的应用进展。

纳米孔三代测序技术在禽流感病毒全基因组测序中的应用

纳米孔(Nanopore)测序技术是一项新兴三代测序技术,具有巨大应用前景,然而在动物病原领域中的应用还处于起步阶段。为探究该技术在禽流感病毒(AIV)全基因组测序中的应用,本研究对采自农贸市场的2份AIV阳性鸡咽喉拭子样品(分别命名为AIV1和AIV2)进行RNA提取,利用AIV通用引物靶向扩增其全基因组,扩增产物经末端修复、3'末端加A碱基、条形码连接和添加测序接头等步骤,完成测序文库制备。经GridION×5Mk1测序仪测序获得7.16G数据,所获得的测序数据经数据质控、过滤去除低质量reads、比对拼接得到AIV全基因组序列,整个试验流程在13 h内完成。同时,采用一代测序方法验证Nanopore测序结果的准确性。测序数据质控结果显示所有读长(reads)的质量分数均大于10,AIV1产生404474条reads,平均reads为996.7 bp,平均reads质量分数为13.8,AIV2产生76589条reads,平均reads质量分数为13.5,平均reads为1095 bp,表明测序数据质量较高;利用Samtools软件统计AIV 8个基因节段的覆盖率和各基因节段位点的测序深度,结果显示AIV1全基因组的覆盖率达100%,平均测序深度为34473×,AIV2全基因组的覆盖率达100%,平均测序深度为7470×,表明拼接结果可靠性高;所得测序结果与一代测序结果通过Geneious Prime软件对比,结果显示,二者的一致性达98.78%~100%,其中AIV1有7个基因节段测序结果的一致性为100%,AIV2有5个基因节段测序结果的一致性为100%,一致性最低的MP基因的一致性也达98.78%,表明本研究的测序方法准确性良好。本研究成功实现Nanopore三代测序技术在AIV全基因组测序中的应用,通过优化扩增条件和数据处理为AIV全基因组的测序提供了一种新方法,在新发突发禽流感疫情应急检测中将发挥重要作用。

全外显子组基因测序辅助诊断原发性纤毛运动障碍

2021年12月,复旦大学附属中山医院收治1例29岁男性患者。该患者反复咳嗽、咳痰、喘息,血清总IgE明显升高,烟曲霉特异性IgE阳性,肺功能检查提示极重度混合性通气功能障碍,结合胸部CT结果,考虑支气管扩张症、变应性支气管肺曲霉菌病。结合其低水平呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)和鼻呼出气一氧化氮(nasal nitric oxide,nNO)、出生后咳嗽不愈、父母近亲结婚等,考虑原发性纤毛运动障碍(primary ciliary dyskinesia,PCD)等遗传性疾病可能。全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)结果显示,患者CCDC40基因14号外显子纯合突变,确诊PCD。

全外显子组测序技术在产前胎儿超声异常中的应用进展

胎儿先天性结构异常作为出生缺陷的重要组成部分,是引起新生儿残疾甚至死亡的重要原因之一。产前诊断是预防出生缺陷的重要举措。通过染色体核型分析、拷贝数变异检测技术等产前诊断技术,部分超声异常胎儿能得到明确诊断,但仍有60%以上病因尚未明确。全外显子组测序技术能在上述检测未见异常时,进一步识别出部分致病基因变异,目前已逐步应用于胎儿多系统异常、骨骼发育异常、中枢神经系统畸形、先天性心脏发育畸形及先天性泌尿系统发育异常等的遗传学病因检测。本文对WES在产前胎儿超声异常中的应用进展作一综述。

应用全外显子组测序技术筛查罕见石骨症致病基因

目的筛查石骨症患者的致病基因,为疾病的基因诊断及预后提供参考。方法收集石骨症患者临床资料及外周血标本,提取DNA,构建全外显子测序文库,进行高通量测序并结合生物信息学技术筛查石骨症致病基因。结果对2例石骨症患者的全外显子进行了分析,平均测序深度分别为169.38X、231.06X,其中患者1携带罕见突变TCIRG1(c.1305+2T>C)、TCIRG1(c.2008C>T)和CLCN7(c.1116C>T);患者2携带罕见突变CLCN7(c.857G>A),生物信息学分析表明患者携带的罕见突变均对基因产物的结构和功能具有不同程度的影响。结论全外显子测序可一次性筛查已知石骨症致病突变,是石骨症致病突变筛查的有效工具,2例石骨症患者的临床病征可能与患者携带的TCIRG1和CLCN7突变密切相关。

基于全基因组重测序技术对平菇白色变异菌株的鉴定及遗传变异研究

以生产上收集的一个平菇白色变异菌株(Po50)、黑色出发菌株(Po51)和一个白色生产菌株(Po9)为材料,采用拮抗、酯酶同工酶和全基因组重测序方法对3个菌株进行鉴定。拮抗和酯酶同工酶结果表明,白色变异菌株和黑色出发菌株之间无明显拮抗和酶谱差异,与生产平菇白色菌株差异较大;进一步通过全基因组重测序技术鉴定结果表明,3个菌株鉴定出大量的SNP(单核苷酸多态性位点)、InDel(插入缺失位点)、SV(结构变异位点)。平菇白色变异菌株Po50检测到SNP、InDel突变总数为1504391个,生产菌株Po9检测到SNP、InDel突变总数为1371818个,黑色出发菌株Po51检测到SNP、InDel突变总数为1501877个,通过生物信息手段分析白色变异菌株黑色出发菌株以及对照菌株Po9基因组间的结构差异,获得遗传变异图谱,可以对变异菌株进行快速精准鉴定。

遗传性球形红细胞增多症3例全外显子组基因测序报道

目的:探讨遗传性球形红细胞增多症(HS)的分子致病机制、临床表现、治疗管理及全外显子组测序(WES)技术的应用价值。方法:采用WES技术对3例HS患者进行基因变异检测,依据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南对变异进行致病性评估。查阅HS相关最新文献,对其分子机制、临床表型和治疗管理进行系统综述。结果:3例患者的临床表现(贫血、黄疸、脾肿大)和主要实验室检测结果(如外周血涂片见球形红细胞明显增多)符合典型HS特征,WES分别检测出SLC4A1(p.R808H)、SPTB(p.Y1606^(*))、SPTA1(p.L2380R)基因突变,口腔黏膜脱落细胞Sanger测序验证均证实为胚系杂合突变,依据ACMG指南均归为致病性突变,其中SPTB(p.Y1606^(*))和SPTA1(p.L2380R)突变属于新发现的致病突变,丰富了相关基因致病突变谱范围。结论:WES技术可发现新的致病基因突变,在HS的分子诊断、治疗管理和遗传咨询等方面发挥重要作用。

运用全外显子组测序技术诊断非综合征性耳聋基因变异

目的评价全外显子组测序(whole-exome sequencing,WES)技术在非综合征性耳聋患者基因变异诊断临床应用的可行性。方法利用Illumina Hiseq2000平台对15例耳聋患者标本进行全外显子捕获测序,重点关注80个耳聋相关基因的序列捕获效率及变异检测情况并运用常规测序验证。结果目标区域(region of interested,ROI)20X以上平均覆盖度为98%;在15份耳聋患者标本中均发现致病性变异,涉及GJB2、SLC26A4、DSPP、TECTA和CHD7基因,其中,无义突变2个,移码突变4个,剪切位点变异1个,其余为错义突变。经常规Sanger测序验证,结果一致。结论全外显子组测序技术可快速可靠诊断非综合征性耳聋患者基因变异。

基于家系全外显子组测序技术鉴定男性不育致病突变

目的:通过全外显子组测序(Whole Exome Sequencing,WES)技术鉴定导致男性不育的遗传因素。方法:收集患者临床表型信息,对患者和家系成员的血液样本进行全外显子组测序,通过纯合区段分析、人群频率和有害性预测进行遗传筛选,鉴定可能的致病突变,并通过物种间序列保守性和蛋白结构预测等分析判断突变的致病性。结果:WES测序结果显示端粒重复结合束形成蛋白2(Telomere Repeat Binding Bouquet Formation Protein 2,TERB2)基因携带的纯合错义突变(TERB2:p.95 Lys>Asn)为潜在致病突变,该突变导致其与TERB1的互作丧失,减数分裂停滞。结论:本研究通过WES技术,成功鉴定出TERB2基因的错义突变为无精子症患者的致病突变,表明WES技术可应用于男性不育遗传诊断,TERB2基因可作为诊断靶点。

单细胞转录组测序技术在脊髓损伤研究中的应用

背景:近年来,单细胞转录组测序技术在脊髓损伤的研究为创伤后中枢神经系统的细胞和分子异质性以及结构变化提供了新的见解。目的:就单细胞转录组测序技术在脊髓损伤的研究进展进行综述,更加全面、深入地阐述单细胞转录组测序技术在脊髓损伤领域的应用。方法:应用计算机系统检索PubMed、Web of Science、中国知网和万方数据库中2009-2023年出版的文献,英文检索词为“single-cell RNA sequencing,spinal cord injury,sequencing technology”;中文检索词为“单细胞转录组测序,脊髓损伤,测序技术”。排除质量较差、内容重复及不相关的文献,最终纳入57篇文献进行综述分析。结果与结论:目前,单细胞转录组测序技术在脊髓损伤的研究可归纳为以下几点:①鉴定了小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、巨噬细胞、B细胞、神经元和神经干细胞等细胞亚群,并识别了这几种亚群的特异性标记基因。②小胶质细胞在脊髓损伤后保持永久活跃,通过增殖、免疫和稳态功能来协调脊髓损伤后的早期阶段。星形胶质细胞以激活的方式在脊髓损伤中发挥许多重要功能,包括维持微环境平衡、清除坏死组织、形成保护屏障以及胶质瘢痕等。巨噬细胞和小胶质细胞均在脊髓损伤后的慢性神经炎症中起重要作用。③神经干细胞和神经元亚群能够在脊髓损伤后进行自我更新,新发现的SCV^(sx2::Hoxa7:Zfhx3→lumbar)和SCV^(sx2::Hoxa10)等神经元亚群可再生到自然靶区,有利于运动功能的恢复。④发现细胞亚群的动态变化提高了研究者们对脊髓损伤病变进程的理解,并为脊髓损伤在不同时间点的治疗提供了新见解。截至目前,这些研究结果均还需要更多的基础研究和足够的临床试验来验证。在未来,单细胞转录组测序技术通过与生物信息学、计算机科学、组织工程学和临床医学等跨学科合作,有望为脊髓损伤的诊疗打开新的一扇窗户。

全外显子组测序诊断Rothmund-Thomson综合征的临床研究

目的 探讨1例Rothmund-Thomson综合征(RTS)患儿的临床表现及诊断,并进行文献复习,以提高对该病的认识。方法 分析2019年5月河南省儿童医院小婴儿病房收治的1例RTS患儿的临床资料,抽取患儿及其父母外周静脉血各2 mL,利用高通量测序进行一家三口全外显子组测序检测。以Rothmund-Thomson综合征、RECQL4基因、Rothmund-Thomson syndrome、RECQL4为检索词,分别在中国知网、万方数据库、PubMed数据库进行中英文文献检索(检索时间从建库至2023年8月)。结果 患儿出生后即出现反复腹泻,生长发育落后,3个月后出现颜面部、臀部皮肤色素脱失。测序结果提示RECQL4基因存在复合杂合突变:c.3237-2A>T和c.1593_1594delTC。2个突变均为数据库和文献未见报道的新突变位点,分别来自患儿父母。文献检索结果:符合检索条件的中文文献10篇、英文文献131篇。结合病例分析和文献复习,该文主要从临床症状及致病基因突变角度出发,重点叙述Rothmund-Thomson综合征的临床特点、成因、诊断及高肿瘤风险。结论 RTS是罕见的常染色体隐性遗传病,以皮肤异色症、白内障、骨骼发育异常或缺如等为主要临床表现,并涉及多个系统受累。RECQL4基因突变检测有助于确诊。该研究发现的2个新突变丰富了RECQL4基因突变谱。

全基因组外显子测序技术在遗传性纤维蛋白原异常家系致病基因的克隆鉴定中的应用

目的研究采用全基因组外显子测序技术在遗传性纤维蛋白原异常家系致病基因鉴定中的应用价值。方法采集12例遗传性纤维蛋白原异常患者及其核心家庭成员外周血检测凝血指标,并提取其基因组DNA进行全基因组外显子测序,分析测序结果,探讨遗传性纤维蛋白原异常的分子机制。结果全基因组外显子测序结果显示:先证者A1、A4以及B2均为FGA基因g.1233G>A突变,A1的妹妹、A4的父亲以及B2的母亲均携带有相同的突变;A2、A7、B4和B5均为FGG基因g.10819G>A突变,家系成员中A2的母亲和外婆、A7的姐姐和女儿、B4的母亲和B5的母亲均携带有相同的突变;A3、A5、A6、B1和B3及其相关亲属共10例携带有FGB基因g.9692A>G突变。先证者及家系主要成员中发生Fg基因突变的成员APTT、PT和TT均明显延长,但Fg活性显著降低。结论遗传性纤维蛋白原异常可由多种Fg基因外显子突变导致,FGB和FGG外显子突变较为常见。

全外显子组测序技术对两个眼前节发育不良家系致病基因检测

目的筛查两个眼前节发育不良(anterior segment dysgenesis,ASD)家系的致病基因突变。方法对2个来自河北和河南的ASD家系进行分析。在获得受检者同意后,对家系成员进行详细的眼科检查,采集外周静脉血,提取全基因组DNA。依据测序需求选取家系1中2例患者及1名正常对照、家系2中1例患者及1名正常对照进行全外显子组测序,对测序结果筛选候选基因,运用Sanger测序进行验证。利用Poly Phen-2,SIFT Human Splicing Finder软件进行突变危害性预测。结果家系1连续3代均有患者发病,符合常染色体显性遗传特征,9例患者有均不同程度的双眼ASD。得到13个SNV和55个In Del候选突变,在候选基因PAX6中,家系1发现一已知错义突变c.T2A(p.M1K);家系2中共8名成员,其中2例患者,在测序中发现一已知剪切位点突变c.357+1g>c。3个预测软件作出危害性预测。结论外显子测序技术快速检测出PAX6基因中T2A(p.M1K)和c.357+1g>c突变,并确定其为ASD的致病突变。

应用全外显子组测序技术鉴定1个白化病家系致病基因HPS1

目的采用全外显子组测序鉴定1个常染色体隐性遗传白化病家系患者的致病基因,探讨其发病机制。方法采集先证者及其家系成员外周血并提取其基因组DNA,对先证者进行全基因外显子组测序,并结合序列变异生物信息学分析方法,鉴定其致病基因,利用Sanger测序对基因突变位点验证。结果全外显子组测序结果显示,先证者HPS1基因存在由c.1276_1279dupGGAG(p.Asp427fs)移码突变和c.398+5G>A剪切位点变异组成的复合杂合突变,而其表型正常的父亲为c.1276_1279dupGGAG(p.Asp427fs)杂合突变,表型正常的母亲为c.398+5G>A杂合突变。结论该白化病先证者由HPS1基因c.1276_1279dupGGAG和c.398+5G>A复合杂合突变导致,此患者被诊断为Hermansky-Pudlak综合征1型。外显子测序技术可以快速准确地筛查白化病候选基因,并明确其具体临床亚型,有利于临床医师积极干预患者潜在并发症以及改善患者生存质量。

全外显子组测序技术检出Kallmann syndrome患者KAL1基因新突变

目的分析Kallmann syndrome家系患者的分子遗传机制。方法利用全外显子组测序技术对先证者进行测序分析,按照ACMG解读规则筛选致病性突变,Sanger测序对所有家系成员验证突变结果。结果捕获且比对到目标区的碱基量为3418.98Mb,平均测序深度为77.66X,覆盖度为99.23%,共检出5056个变异,3174为罕见变异(RSV),KAL1基因c.1735_1736insT突变为疑似致病性突变,且满足家系共分离。结论 KAL1基因c.1735_1736insT框移突变为新的疑似致病性突变。

全外显子组测序技术探寻家族性颅内动脉瘤致病基因的研究进展

家族性颅内动脉瘤的病因及发病机制仍不明确,其流行病学及遗传学特点表明遗传因素在其发病机制中发挥重要作用。全外显子组测序技术可用于家族性颅内动脉瘤的遗传学研究,并定位一些新的致病基因,本文将对其进行综述。

全外显子组测序对性发育异常患者的分子遗传学病因分析

目的通过全外显子组测序(WES)技术分析性发育异常(DSD)患者的分子遗传学病因,以加深对DSD致病机制的认识。方法收集2008年3月-2021年8月于云南省第一人民医院就诊的60例DSD患者的临床资料进行回顾性分析,并对其中1个先证者进行家系研究。提取所有患者的外周血基因组DNA进行WES测序分析,WES结果利用SAMtools软件、单核苷酸多态性(SNP)数据库、InDel数据库进行SNP和InDel检测;采用ExomeDepth进行外显子水平的拷贝数变异(CNV)检测;应用PolyPhen-2、Mutation taster、PyMol软件进行突变的有害性预测,并采用Sanger进行测序验证。结果60例DSD患者中,22例为46,XX DSD,38例为46,XY DSD。22例46,XX DSD患者中14例存在SRY基因;在另外8例患者和其中1个先证者家系中,2例患者的NR5A1、PROKR2和ANOS1基因发生单核苷酸变异(SNV),4例患者中的CYP21A2基因发生CNV,其中CYP21A2 EX1 Dup已有该变异的相关致病性报道,其余3个CNV为意义未明的变异,2例未检出与DSD相关的基因突变位点。38例46,XY DSD患者WES分析结果中,14例中检出了10个致病或疑似致病变异位点,包括SRY、AR、SRD5A2、CYP17A1、NR5A1等5个基因;5例中检出CYP21A2、AKR1C2、CBX2、NR5A1基因的5个疑似致病的CNV,其中3个微缺失,2个微重复。WES结果中NR5A1(c.722G>T、c.48C>G)、ANOS1 c.564A>T变异为首次报道的位点,在检出的CNV中,CYP21A2 EX1 Dup在相关数据库中有致病性的报道,其余未见报道。结论WES技术的应用提高了对DSD的诊断能力,拓展了现有的DSD相关致病基因突变谱数据,丰富了对DSD致病机制的认识,可为开展遗传咨询提供帮助。

小麦茎秆性状的转录组测序及全基因组关联分析

小麦的茎秆性状与倒伏紧密相关,发掘其显著关联的基因位点和候选基因,为解析小麦茎秆性状的遗传机制和分子标记辅助育种提供依据。本研究以黄淮南部地区的192份小麦品种为材料,利用小麦660KSNP芯片对7个环境成熟期和4个环境灌浆中期的14个茎秆性状进行了全基因组关联分析(GWAS),同时利用RNA-seq分析了基部前二节间强度和直径的差异表达基因。结果表明,所有性状的成熟期与灌浆中期的差异均达到极显著水平。与灌浆中期相比,成熟期的重心高度增幅较大,基部第二和第三节间长度增加,其他性状均降低。GWAS共检测出163个与茎秆性状相关的稳定SNP标记(MTA),其中45个具有基因或蛋白注释,与转录组联合分析,共筛选到3个与小麦茎秆性状相关的候选基因。推测候选基因TraesCS5A02G522100通过合成异戊二酸类化合物调节小麦的光合作用以及通过调节固醇的生成提高细胞膜的稳定性和渗透性,进而促进茎秆的发育,改善茎秆性状。候选基因TraesCS1D02G390600直接参与小麦茎秆细胞分裂和器官的形成,使茎秆变粗,充实度增加。候选基因TraesCS7A02G481800在小麦中通过参与细胞间的信号传递过程,调控茎秆的发育、应激响应等过程。这些候选基因通过qRT-PCR验证,其基因的表达趋势与转录组测序所得结果基本一致。

全外显子组测序在高度近视病因学中的研究进展

高度近视的发病与遗传因素密切相关。近年来,随着全外显子组测序技术广泛应用于高度近视的遗传学研究,基础免疫球蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白1、脯氨酰4-羟化酶α多肽Ⅱ等高度近视易感基因陆续被鉴定出来,分别涉及巩膜重塑、能量代谢、细胞凋亡等生物学途径,进一步揭示了高度近视的发病机制。本文就近年来通过全外显子组测序技术鉴定高度近视研究较多的15个遗传易感基因及其变异的相关信号通路研究进展进行综述。