猫冠状病毒的全基因测序与遗传进化分析

为了解猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的基因组特征和遗传变异情况。本试验利用RT-PCR方法从患病猫组织中鉴定出1株Ⅰ型FIPV病毒,通过RT-PCR扩增18个片段的目的基因,连接到p CE-TA克隆载体后测序,对测序结果进行拼接获得FIPV NJ-20-a株的全基因序列,对获得的全基因序列和编码区序列以往毒株进行同源性分析,并构建S基因系统进化树。结果显示NJ-20-a株与以往毒株同源性较低,新分离毒株基因组变异较大,通过编码区序列同源性分析发现S基因和3a、3b、3c基因是变异的主要区域,S基因系统进化树发现NJ-20-a株处于Ⅰ型FIPV分支内的单独分支,与以往毒株进化差异较大,表明猫冠状病毒在不同地域遗传进化过程中差异较大。本研究通过对FIPV NJ-20-a毒株进行全基因测序和分析,为猫冠状病毒的分子生物学研究和流行性学的调查提供了一定基础。

1株LpsB突变致多黏菌素B耐药鲍曼不动杆菌的全基因测序分析

目的研究1株多黏菌素B高水平耐药的多重耐药鲍曼不动杆菌的全基因组测序的分子特点。方法将1株分离自脑脓肿患者脑脊液标本的多黏菌素高水平耐药鲍曼不动杆菌Z198株作为目标研究菌,通过Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq PE150测序平台对其进行全基因组测序,再通过各数据库进行比对分析检测菌株的多位点序列分型(MLST)、抗菌药物耐药基因、毒力基因,同时采用Circos软件对样品基因组组装和注释结果进行可视化分析。Z198基因组上交NCBI数据库。结果全基因组测序发现该菌株含有1个染色体、1个固有质粒,11个基因岛、4个前噬菌体。通过数据库比对,本菌为ST2型,共携带高达34种抗菌药物耐药基因,主要为LpsB、bla OXA-23、bla_(OXA-66)、bla_(ADC-73)等,同时含有OmpA、磷脂酶C、包膜、溶血素、生物膜调控系统等19种主要毒力因子。结论本研究检出1例LpsB四点突变导致多黏菌素B耐药的鲍曼不动杆菌。该菌株同时携带多重耐药基因及毒力因子。多黏菌素耐药鲍曼不动杆菌外膜脂质修饰的耐药机制及分子流行病学需高度持续关注。

芯片及全基因测序对先天心脏病的产前诊断

国内的许多高水平文章在国际期刊上发表受到广泛关注,我刊将邀请她们来分享最新研究成果,同时也欢迎各位青年才俊以视频的形式“毛遂自荐”。本期由同济大学附属第一妇婴保健院的邢娅医生分享2022年5月发表于Prenatal Diagnosis杂志(DOI: 10.1002/pd.6168)的关于先天性心脏病产前诊断的一项研究。

山羊鼻内肿瘤病毒广东株的全基因测序与遗传进化分析

为了解山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的基因组特征和遗传变异情况,通过RT-PCR及序列分析方法从广东省某羊场送检病羊组织中鉴定出一株ENTV-2,将其命名为GDZJ2022。全基因组测序结果分析显示,GDZJ2022与GenBank中26株ENTV参考毒株核苷酸序列相似性为86.5%~96.9%,其中与四川ENTV-2-CHN3毒株序列同源性最高(96.9%),并处于同一分支。env核苷酸序列分析结果显示,GDZJ2022与四川株ENTV-2-CHN1同源性最高(98.6%);gag核苷酸序列分析结果显示,GDZJ2022与GDQY-2017同源性最高(95.2%)。

野猪源与家猪源PRRSV陕西分离株全基因测序与遗传进化分析

【目的】研究野猪源与家猪源猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,PRRSV）陕西分离株的遗传变异情况及分子生物学特征。【方法】根据VR-2332和HB-1（sh）/2002毒株序列设计引物,对2株PRRSV陕西分离毒株Shaanxi-1（家猪源）、Shaanxi-2（野猪源）全基因分段进行扩增并测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因,然后进行序列的比对分析。【结果】PRRSV Shaanxi-1、Shaanxi-2毒株高度同源且均属于美洲型毒株,它们与2006年以前分离的毒株相比存在明显差异（与BJ-4株的核苷酸同源性仅为89%）,而与高致病性PRRSV（HP-PRRSV）保持较高的同源性（相似率为99%左右）。Shaanxi-1、Shaanxi-2分别呈现不同的变异特点,Shaanxi-1 ORF3、ORF5基因变异较大,ORF6、ORF7较为保守;Shaanxi-2 ORF7基因变异最大,ORF3~ORF6较为保守。分析发现,Shaanxi-1、Shaanxi-2具有HP-PRRSV的分子特征,但部分位点氨基酸的突变明显区别于HP-PRRSV。【结论】不同来源的Shaanxi-1、Shaanxi-2毒株均属于HP-PRRSV演化中的一个分支,但其发生了部分变异,使其具备了新的特点。

全基因测序确定囊性纤维化患者之间脓肿分枝杆菌传播的研究：回顾性队列分析

背景和目的越来越多的肺囊性纤维化患者感染脓肿分枝杆菌，引起进行性的肺破坏，治疗难度非常大，此类患者如何感染脓肿分枝杆菌的机制尚不明确，越来越多的证据表明可能存在患者之间的传播，本研究的目是为了明确肺囊性纤维化患者感染脓肿分枝杆菌的机制。方法收集2007至2011年英国剑桥派普沃斯肺部感染成人囊性纤维化中心诊治的31位患者，通过持续分离获得168株脓肿分枝杆菌菌株，对菌株进行全基因测序及抗菌药物敏感试验。

全基因测序(WGS)在肠杆菌科细菌中的应用研究

全基因测序(whole genome sequencing, WGS)是指通过高通量测序技术对物种个体或群体进行测序,分析获得的基因组图谱,找出其差异性,以在全基因组水平探究物种进化规律和筛选功能基因的研究技术。因其有获取信息全面、精确、高通量及高分辨率等优点,现已在细菌流行病学中广泛应用。目前有大量关于肠杆菌科细菌的WGS研究,探究细菌的致病、耐药机制等。本文主要概述和讨论了WGS在肠杆菌科细菌中的应用,并简述了其关键要点和应用前景,期望为WGS在细菌流行病学中的深入应用提供理论参考。

致伤口感染犬巴斯德菌耐药基因全基因测序分析

目的分析致伤口感染犬巴斯德菌耐药基因,为临床治疗提供参考。方法采集1例犬咬伤患者右足渗出脓液样本,进行细菌培养、鉴定及体外药物敏感性试验。通过全基因测序结合生物信息学方法分析临床分离株携带的耐药基因。结果临床分离株细菌鉴定结果为犬巴斯德菌,体外药物敏感性试验结果显示其对青霉素、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林、头孢曲松、左氧氟沙星、四环素、阿奇霉素和复方磺胺甲噁唑均敏感,对红霉素耐药。全基因测序结果显示分离的犬巴斯德菌含有18种耐药基因,包括喹诺酮类耐药决定区域编码基因parC、parE、gyrA和gyrB,但未发现基因突变。结论发现犬巴斯德菌携带喹诺酮类耐药决定区域编码基因parC、parE、gyrA和gyrB,因细菌耐药与其对抗菌药物选择压力基因突变有关,随着喹诺酮类抗菌药物的使用,细菌耐药性可能会迅速发展,应引起临床重视。

鹅细小病毒辽宁分离株全基因测序与遗传演化分析

为研究辽宁地区鹅细小病毒的遗传演化及分子生物学等特征,参考GenBank已公布的鹅细小病毒DY16毒株设计8对引物,对辽宁分离株全基因分段进行扩增并测序,采用DNAMEN软件将测序结果依次拼接后进行序列比对分析。结果表明:辽宁分离株基因序列全长5 106 bp,并命名为LNGPV20。基因组5’端和3’端具有一致的末端倒置重复序列(ITR),均由444个碱基组成,包括362个碱基配对形成的回文茎部、43个碱基构成的泡区以及39个碱基不参与序列的反向互补配对。辽宁分离毒株与14个毒株全基因序列同源性在93.2%~98.9%之间,表明国内鹅细小病毒全基因序列同源性较高,可能是近年来养鹅业迅速发展,鹅苗流通增加,交叉感染所致。

辣椒轻斑驳病毒凤城分离物的鉴定、全基因测序及系统进化分析

辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus(PMMoV)属于烟草花叶病毒属,是辣椒上重要的病原病毒之一,近年来PMMoV对辽宁部分辣椒产区造成严重危害。本文采用DAS-ELISA检测以及RT-PCR的方法首次从辽宁省凤城市蔬菜产区辣椒病叶中检测出PMMoV,暂命名为PMMoV-FC。设计3对特异性引物对其进行扩增并测序后得到该病毒分离物全基因序列。将PMMoV-FC的全基因序列与已报道的国内外9个PMMoV分离物进行同源性分析,结果表明,其同源性介于94.3%~99.7%之间。基于全基因序列的系统发育进化分析表明,PMMoV-FC与国内分离物、日本分离物以及美洲分离物亲缘关系密切,而与韩国和西班牙分离物亲缘关系稍远。鉴于该病毒在辣椒上造成的严重危害,对于PMMoV-FC在辽宁地区的发生以及防治仍需进行更为详细的研究。

牛源乳腺致病性大肠杆菌JL05全基因测序及毒力和耐药基因分析

为研究一株从奶牛乳样中分离到的乳腺致病性大肠杆菌(MPEC)JL05的进化分群情况、耐药表型和耐药基因之间的相关性、毒力因子分布情况,本研究采用PCR法、微量肉汤稀释法和高通量测序法对其进化分群、16种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)、毒力基因、耐药基因的检测和分析。PCR检测结果表明,MPEC JL05属于B2群。MIC检测结果表明,MPEC JL05除对磺胺异恶唑中介、对呋喃妥因敏感外,对β-内酰胺、头孢菌素、氨基糖苷、抗叶酸、喹诺酮、大环内酯、四环素、苯丙醇类等8类14种抗菌药物均耐药。全基因测序结果表明,MPEC JL05编码基因中存在MPEC特有的fec基因座;VFDB数据库分析表明MPEC JL05具有黏附、侵袭、转运、铁摄取、分泌系统、细菌毒素6类80个毒力基因,并发现了耶尔森菌强毒力岛(HPI);CARD数据库分析表明MPEC JL05菌株具有参与抗生素外排、抗生素失活、抗生素靶点改变、降低对抗生素的渗透性等4类耐药机制的53个耐药基因,且在质粒的耐药基因上下游发现了多个转座酶及整合酶基因。本研究揭示了MPEC JL05复杂的进化史,为更全面的认识MPEC基因组特征、致病力及耐药传播机制提供了参考。

输入性黄热病毒全基因测序完成

近日，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所和北京市疾病预防控制中心合作，采用核酸检测方法确诊了我国首例输入性黄热病病例，并获得黄热病病毒的全基因序列。该病毒基因组全长10823个碱基，和安哥拉分离的黄热病毒具有高度同源性。

全基因组重测序解析重庆武隆中华蜜蜂遗传变异及种群分化特征

【目的】解析重庆武隆中华蜜蜂的遗传变异及种群分化特征,为该地区传粉昆虫的遗传多样性研究提供理论参考。【方法】对重庆武隆中华蜜蜂进行全基因组重测序,并结合我国其他地区57群中华蜜蜂的重测序原始数据进行种群遗传分化分析。【结果】测序共获得武隆中华蜜蜂有效数据(clean data)33.53 Gb,发现高质量单核苷酸多态性(SNP)位点共3886321个,小片段的插入与缺失(small indel)位点1392028个。在武隆中华蜜蜂样品中筛选出具有相同变异位点的非同义SNP突变基因589个,编码区发生small indel的基因214个。这些基因主要富集于赖氨酸降解、轴突导向、细胞外基质受体互作和丝裂原活化蛋白激酶信号通路。最终获得16个具有相同SNP和small indel的突变基因,其中包括嗅觉受体基因2个、细胞色素P450基因1个。武隆中华蜜蜂与我国其他地理型中华蜜蜂可能存在显著的遗传分化,与华中中蜂和北方中蜂(陕西安康)种群的亲缘关系较近。【结论】推测氨基酸代谢、神经系统发育、嗅觉进化、抗逆性能改善以及对温度偏好性的转变与武隆中华蜜蜂适应重庆本地自然环境有关。随意引种可能导致优质中华蜜蜂品种混杂,生产性能和抗逆性能下降。因此,需要保护本土优质中华蜜蜂种质资源。

全基因组测序技术在结核病中的应用进展

全基因组测序是高通量测序技术,因偏倚小、成本不断降低等优势而广泛应用于疾病的临床诊断和研究中。近年来,结核病带给全球公共卫生的压力不容小觑。目前,全基因组测序技术在结核病诊断、耐药性检测、致病机制研究及其传播防控等方面面临诸多挑战。本文阐明全基因组测序技术在结核病中的最新应用进展。

基于全基因组重测序研究文昌鸡产蛋性能的影响因素

旨在通过研究文昌鸡进化过程的特征,深入理解影响产蛋性能的因素,为文昌鸡优良品种选育提供基础。本研究采集35只健康文昌鸡(35周龄,15公,20母)和30只健康江汉鸡(35周龄,10公,20母)的血液组织各3 mL提取DNA,采用全基因组重测序方法建库测序。首先,对于原始测序数据用trimmomatic软件过滤,获得高质量序列比对到鸡的参考基因组,GATK软件提取变异位点SNPs,设置参数质控去除低质量、假阳性变异位点,进一步采用snpEff对过滤的SNPs进行基因结构和功能注释。然后,比较文昌鸡和江汉鸡的群体结构差异,分别设置评估群体差异参数Fst、ROD、Tajima′s D的阈值,筛选受到选择的区域,并对这些区域的基因进行功能富集。结果表明:1)文昌鸡测序获得1.05 Tb clean data,平均每个样本大约29.97 Gb,测序深度大约28×;江汉鸡测序获得1.10 Tb clean data,每个样本大约36.72 Gb,测序深度大约35×;平均比对率>98%。2)两个群体基因结构注释总数均是内含子>基因间区>上下游调控区>编码区;系统进化树和主成分分析显示文昌鸡和江汉鸡亲缘关系较远;文昌鸡的连锁不平衡程度低于江汉鸡。3)与产蛋性能相关基因的功能富集结果主要包括3种必须氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)代谢途径、钙离子沉积、金属肽酶抗氧化、肾上腺素和催乳素受体活性等功能,而且这些通路的基因都位于受到强烈选择的区域。综上所述,影响文昌鸡产蛋性能的因素主要包括必须氨基酸代谢、矿物质沉积和抗氧化、性腺激素分泌,这3个因素在进化过程中都受到强烈选择,对产蛋性能发挥重要调控作用。从进化分子遗传学角度研究鸡的产蛋机理,不但能够促进理解文昌鸡产蛋性能的进化特征,而且有助于加速高产蛋鸡品种或品系的培育。

低深度全基因组测序技术在复发性流产遗传学病因诊断中的应用

目的应用低深度全基因组拷贝数变异分析(CNV-seq)技术研究胚胎染色体异常在复发性流产(RSA)及偶发流产(SA)中的差异。方法采集158例RSA患者(RSA组)和244例SA患者(SA组)的流产组织进行CNV-seq检测,对可疑染色体异常的夫妇进行高分辨外周血染色体核型检测。结果402例样本中有2例检测失败,检测成功率99.5%(400/402)。共检测出染色体异常238例(59.5%),包括染色体数目异常212例(89.1%),致病性拷贝数变异25例(10.5%),单亲二倍体1例(0.4%)。RSA组和SA组总体染色体异常、非整倍体、三倍体发生率差异均无统计学意义。RSA组致病性拷贝数变异在染色体异常中的构成比显著高于SA组(P<0.05)。高分辨外周血核型分析检测共发现4例平衡易位携带者。35~39岁年龄段中SA组胚胎染色体异常率高于RSA组(P<0.05)。2组早期流产中胚胎染色体异常率均明显高于中期流产;早期流产中,SA组的流产组织(POC)染色体异常率高于RSA组(P<0.05)。结论CNV-seq可以对胚胎染色体数目异常和染色体片段重复/缺失进行精准诊断,在RSA和SA的遗传学病因诊断中同样重要,可为再生育指导提供依据。

兔源肠致病性大肠埃希菌全基因组测序及毒力和耐药基因分析

目的揭示一株从腹泻实验兔中分离到的肠致病性大肠埃希菌ILAREc-01的基因组特征、毒力基因和耐药基因分布情况。方法采用高通量测序法对基因组序列进行测定,采用VFDB、ARDB、CAZy、SWISS-PROT、COG、CARD、KEGG、T3SS等8个数据库对基因组中的基因功能进行预测,并且对ILAREc-01菌株进行了遗传进化分析。结果ILAREc-01基因组中编码5249个基因;CARD数据库分析表明ILAREc-01菌株具有7类耐药机制的59个耐药基因;通过VFDB数据库分析,在ILAREc-01中注释了553个毒力基因,并发现了肠细胞脱落位点毒力岛(LEE);ILAREc-01与FORC028、E2865和110512株具有较高的同源性。结论本研究进行了兔源肠致病性大肠埃希菌ILAREc-01的全基因组测序,完成了毒力基因和耐药基因的注释,并开展了遗传进化分析,为揭示该病原的致病机制和科学防控实验兔大肠埃希菌病提供了数据支撑。

鹅源副鸡禽杆菌全基因组重测序及比较基因组学分析

为了分析鹅源副鸡禽杆菌(Apg)与鸡源菌株的基因组差异,对3株鹅源Apg和4株鸡源Apg进行全基因重测序及基因组分析。全基因重测序结果显示7株菌株基因组片段大小为2.567 832~2.607 127 Mb, GC含量介于40.80%~40.93%之间。SNPs同源性分析结果显示,3株鹅源菌株和鸡源C-AP3株聚集在p4chr1株的小分支上,另外3株鸡源菌株分布在其它国内菌株分支上。基因同源性分析结果显示鹅源菌株特有基因76个,鸡源菌株特有基因37个。对鹅适应性基因的筛查共聚类出79个基因,其中编码已知蛋白的基因有22个,其余编码假定蛋白;对鸡适应性基因的筛查聚类出39个基因,其中10个编码已知蛋白,29个编码假定基因。通过比较基因组学发现与Apg宿主适应性有关的基因为118个,为进一步阐释Apg跨物种感染的分子生物学机制奠定了基础。

基于全基因组重测序解析皮山红羊群体遗传结构及产羔数候选基因研究

[目的]皮山红羊是分布于新疆和田地区的新发现多羔性地方绵羊品种。本研究基于全基因组重测序技术从基因组水平上了解皮山红羊的群体遗传结构及产羔性状受选择信号区域,并对候选基因进行验证。[方法]选择30只连续产2~3羔的经产皮山红羊母羊为高繁组(high fertility, HF),30只连续产单羔的经产皮山红羊母羊为低繁组(low fertility, LF),对这两个群体进行全基因组重测序。应用主成分分析(PCA)、系统进化树、群体遗传结构及全基因组扫描(Fst&θπ)等综合分析法确定候选区域,进一步筛选皮山红羊产羔性状候选基因。采用飞行质谱分型技术对候选基因进行分型验证。[结果]皮山红羊高、低繁殖组群体连锁不平衡(LD)分析衰减曲线相似,系统进化树显示两组群体分化程度不明显。PCA结果显示,两个群体明显聚成一簇,个别个体离群,其位置及相互关系符合进化树结构以及群体结构结果。设置同时达到Top 1%Z(Fst)值和θπ值的窗口为候选区域,共注释229个强选择信号,HF和LF组注释基因分别为86和143个,其中筛选到42个可能与繁殖性状相关的候选基因,如MARF1、CHGA、BMPR1B、IMMP2L、CDK14、ZDHHC3、CCDC71、DSCAML1、LIMK2、P2RY14等。经GO与KEGG通路分析发现,GO功能显著富集在钠离子跨膜转运蛋白活性的调控、凋亡过程的调控、钠离子通道调节剂活性、G蛋白偶联受体结合、G蛋白偶联嘌呤核苷酸受体活性等条目,KEGG显著富集通路主要与信号传递、信号通路、物质代谢等通路有关。分型结果表明,MARF1基因有11个SNPs位点在皮山红羊群体中真实存在,其中,g.14023542 T>A、g.14036507 A>G、g.14046123 C>T位点与群体平均产羔数显著关联,且前2个突变位点呈现强连锁关系(r2>0.3),g.14023542 T>A位点TT基因型具有最多的平均产羔数(1.901±0.675)。[结论]皮山红羊高繁组和低繁组两个群体遗传背景相似,具有一定程度的分化,但分化不明显。MARF1、CHGA、BMPR1B、IMMP2L、CDK14、ZDHHC3、CCDC71、DSCAML1、LIMK2、P2RY14等基因可能是影响皮山红羊产羔性状的候选基因。MARF1基因的3个SNPs位点可作为皮山红羊产羔性状潜在分子选育标记。

药物敏感性试验与全基因组测序检测抗结核药物耐药性的比较研究

目的通过药物敏感性试验(DST)和全基因组测序(WGS)检测结核分枝杆菌(MTB)的耐药情况,比较二者一致性,探讨全基因测序用于MTB耐药性检测的特点。方法选取2018-2020年留存于四川大学华西医院共71例MTB临床分离株,采用DST(氧化还原指示剂法)和WGS两种方法对菌株进行异烟肼(INH)、利福平(RIF)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、莫西沙星(MFX)、氧氟沙星(OFX)、左氧氟沙星(LFX)、卡那霉素(KAN)、阿米卡星(AMK)、卷曲霉素(CPM)、乙硫异烟胺(ETH)、利福布汀(RFB)、对氨基水杨酸(PAS)和氯法齐明(CLO)共14种药物的耐药性检测,并对结果进行Kappa检验分析。结果两种方法对RIF、RFB、SM、MFX、OFX和LFX 6种药物耐药性检测的符合率均超过90.00%,Kappa值均大于0.80,一致性较好;INH和EMB耐药性检测的符合率分别为84.51%,81.69%,Kappa值分别为0.68和0.54,一致性一般;AMK和KAN两种方法检测的耐药株未超过2株,耐药率小于3.00%;CPM、ETH、PAS、CLO耐药性检测的符合率范围为61.97%~91.55%,Kappa值均小于0.40,一致性较差。结论WGS检测不同抗结核药物耐药性的能力存在差异,其检测RIF、RFB、SM、MFX、OFX和LFX 6种药物耐药性效果较佳,而检测其他抗结核药物耐药性与DST相比较仍存在一定差异,需要进一步明确相关药物的详细耐药机制,并对WGS用于耐药性分析的标准化进行探索。