利用人类全基因组亚硫酸氢盐测序数据检测CNVs的研究

DNA甲基化异常可能导致拷贝数变异(copy number variants,CNVs)的发生,而CNVs的发生又可能改变DNA甲基化水平。全基因组亚硫酸氢盐测序(whole genome bisulfite sequencing,WGBS)技术能够获得DNA水平的测序数据,具有挖掘CNVs的潜力和优势,但利用WGBS数据挖掘CNVs的效果尚不清楚。本研究选取了5款检测CNVs不同策略的软件(BreakDancer、cn.mops、CNVnator、DELLY、Pindel),基于人类的真实(2.62 billion reads)和模拟(12.35 billion reads)测序数据,进行150次CNVs检测,评估CNVs检出数量、精确率、召回率、相对检出能力、内存占用和运行时间等指标,旨在讨论利用WGBS数据检测CNVs的最佳方案。基于真实WGBS数据,Pindel检出缺失型和重复型CNVs的数量最多,CNVnator对缺失型CNVs的检测精确率最高,cn.mops对重复型CNVs的检测精确率最高,Pindel对缺失型CNVs的召回率最高,cn.mops对重复型CNVs的召回率最高。基于模拟WGBS数据,BreakDancer检出缺失型CNVs数量最多,cn.mops检出重复型CNVs数量最多,CNVnator对缺失型和重复型CNVs的检测精确率和召回率均为最高。与全基因组测序数据相比,CNVnator在真实和模拟WGBS数据中检出CNVs的能力与之相当。此外,DELLY和BreakDancer的内存占用峰值和CPU运行时间最小,CNVnator的内存占用峰值和CPU运行时间最大。结果表明,利用WGBS数据检测CNVs具有可行性,使用CNVnator和cn.mops在WGBS数据上检测CNVs的准确率较高,这些工作为利用WGBS数据深入研究CNVs和DNA甲基化之间的相互关系提供一定的参考和帮助。

亚硫酸氢盐-基因组测序法在检测基因异常甲基化中的应用

目的:介绍一种准确、敏感的检测多个标本、多个CG二核苷酸甲基化状态的方法。即亚硫酸氢盐-基因组测序法(BisulfiteGenomicSequencing,BGS)。方法:单链DNA的胞嘧啶可被亚硫酸氢盐修饰转变成尿嘧啶,而5'甲基胞嘧啶仍保持不变。这种修饰处理可在甲基化和非甲基化基因组DNA间产生DNA序列差异,而这种DNA序列差异可通过BGS法较为灵敏地筛查出。利用该原理检测肝癌细胞AFP基因启动子区CG二核苷酸甲基化状态。结果:在癌细胞中发现两种异常甲基化,即高度甲基化及部分甲基化。结论:BGS法在基因甲基化检测中将有很大的应用潜能,为探讨肿瘤发生机制提供了新的分子分析方向。

感染大片形吸虫水牛脊髓全基因组DNA的甲基化及其功能的分析

为探究感染大片形吸虫后不同时间水牛脊髓全基因组DNA甲基化的类型、占比及其感染后差异甲基化区域(DMR)涉及的功能及信号通路,本研究将大片形吸虫囊蚴经口灌胃感染8~10月龄水牛,分别于感染后3 d(J01)、10 d(J02)、28 d(J03)、42 d(J04)、70 d(J05)和98 d(J06)采集水牛脊髓,利用全基因组重亚硫酸盐测序技术(WGBS)对基因组DNA的甲基化测序,测序数据经过滤筛选后,采用Bismark软件分析各组水牛脊髓基因组DNA甲基化的类型及其占比(某种类型甲基化序列在该组全部可用测序序列中的占比以及该组某种C类型甲基化的数量在全部C类型甲基化中的占比),并采用weight methylation level对各组水牛脊髓基因组DNA 7个功能区域的甲基化进行聚类分析。WGBS测序结果经过滤后显示,平均每组测序长度为100.29 Gp,Q20%(质量值≥20的碱基占总碱基数的百分比)和Q30%分别达到95%和85%以上,6组样品亚硫酸盐(BS)转化率均大于99%,表明WGBS测序结果准确可靠;各组样品DNA甲基化类型和占比的分析及统计结果显示,J01~J06组基因组分别包含CG、CHG、CHH 3种类型的甲基化(mCG、m CH及m CHH),且以m CG类型占比最多(63.1%~71.7%,80.11%~85.73%),m CHH类型(0.9%~1.2%,11.27%~15.18%)及m CHG类型均较少(1.0%~1.2%,3.00%~4.84%);聚类分析结果显示,上述3种类型的甲基化主要分布在水牛脊髓基因组第1内含子和内部内含子。上述结果表明,感染大片形吸虫后水牛脊髓基因组DNA甲基化类型以m CG为主,且第1内含子和内部内含子的甲基化可能影响该两个区域相关基因的正常表达。利用R软件包分析各组水牛脊髓基因组之间是否存在DMR,并采用基于模型的亚硫酸氢盐测序数据分析(MOABS)筛选并统计各组之间的DMR及DMR的数量;采用DAVID软件分析各组DMR在其相应基因组中的分布;采用R语言对各组的DMR进行GO功能注释和KEEG富集分析。DMR的筛选及统计结果显示,各基因组间均存在DMR,且各组间均以CG类型DMR数量的差异最大。其中,J06与J01(7134个)、J06与J02(7174个)、J06与J03(6743个)、J04与J03组(11611个)之间DMR数量的差异最大,且96.42%~99.04%的DMR分布在基因组基因间区,0.96%~3.59%的DMR分布在基因组启动子区。DMR的GO功能分析显示,各组间CG类型DMR的GO功能注释结果基本相似,主要富集在细胞进程、生物调节、代谢过程、结合及催化活性等生物学过程;KEGG分析结果显示,各组间尤其是在感染后期(J06组和J04组)DMR主要富集在癌症及PI3K-Akt等信号通路中。上述结果表明,在大片吸虫慢性感染的过程中,尤其在感染中后期对水牛脊髓基因组基因间区相关基因的表达有影响,且甲基化的DNA可能主要通过以上两个信号通路影响相关基因的表达,进而影响水牛脊髓的各种生物学功能,最终引起水牛中枢神经系统疾病。这在一定程度阐释了寄生在肝脏的片形吸虫影响宿主中枢神经系统的机制。本研究为深入探究大片形吸虫感染对水牛神经系统的影响机制奠定了实验基础。

刺参基因组DNA甲基化水平及模式对温度变化的响应

本研究为了探讨刺参(Apostichopus japonicus)在不同温度胁迫下的DNA甲基化水平与甲基化模式变化,利用全基因组重亚硫酸盐测序技术(WGBS)和酶联免疫吸附法(ELISA)对刺参在3个温度下(20℃、26℃和32℃)的纵肌、呼吸树、消化道和体壁4个组织进行分析。WGBS测序结果显示,在消化道组织中,20℃、26℃和32℃温度组全基因组总甲基化水平分别为(1.70±0.01)%、(1.79±0.11)%和(1.59±0.04)%,26℃组处于休眠状态,刺参消化道基因组甲基化水平升高,而32℃组高温胁迫下,甲基化水平下降;在总甲基化位点中,CG类型是主要的甲基化修饰(96%以上),CHH和CHG位点占比较低;30%甲基化水平的甲基化位点中,CHG和CHH为本类型甲基化的最高点,且显著高于CG类型。ELISA检测结果显示,3种不同温度下,刺参呼吸树和消化道组织的甲基化水平范围为2.68%~3.29%,均高于纵肌和体壁组织;温度变化后,刺参呼吸树和消化道组织的总甲基化水平均有显著变化,而纵肌和体壁的总甲基化水平基本不变,表明DNA甲基化可能参与刺参的高温胁迫调控机制。刺参应对温度变化过程中DNA甲基化水平的研究,从表观遗传学视角解析温度升高对刺参不同组织的影响,可为丰富刺参甲基化研究内容和无脊椎动物的甲基化发生规律提供参考。

尖音库蚊复合体蚊虫DNA甲基化水平分析

目的分析比较尖音库蚊复合体中淡色库蚊、致倦库蚊、骚扰库蚊的DNA甲基化水平以及致倦库蚊吸血前后DNA甲基化水平。方法采集羽化后5 d且未吸血的3个库蚊亚种和吸血3 d的致倦库蚊,提取DNA,超声切割为约250 bp的片段后进行测序,测序数据与致倦库蚊基因组序列(Taxonomy:ID7176)进行比对,获取全基因组胞嘧啶碱基甲基化信息。从基因组、染色体和染色体元件水平分析3个库蚊亚种的甲基化水平(甲基化水平高于3%定义为高甲基化)。比较未吸血的3个库蚊亚种间以及吸血前后致倦库蚊的甲基化水平差异,P<0.001且甲基化差异绝对值>5的位点记为差异甲基化位点;Q<0.05且甲基化差异绝对值>3的区域记为差异甲基化区域(DMR)。将距离DMR最近的转录起始位点(TSS)所在基因记为DMR相关基因,对其进行基因本体论(GO)富集分析。结果淡色库蚊、骚扰库蚊和致倦库蚊全基因组甲基化水平分别为0.454%~0.672%、0.491%~0.649%和0.499%~0.655%(均低于3%),CHH位点甲基化水平分别为0.631%、0.618%和0.624%,均高于CHG位点的0.567%、0.559%、0.559%(t=7.14、83.43、6.87,均P<0.05)和CG/CpG位点的0.508%、0.505%、0.505%(t=10.59、12.52、13.33,均P<0.05);3个库蚊亚种共有的高甲基化位点有56个、高甲基化区域有11个。淡色库蚊、骚扰库蚊和致倦库蚊之间全基因组甲基化水平差异无统计学意义(F=0.07,P>0.05),1号染色体(0.568%、0.562%、0.565%)、2号染色体(0.573%、0.564%、0.566%)、3号染色体(0.575%、0.566%、0.569%)的甲基化水平差异均无统计学意义(F=0.05、0.11、0.13,均P>0.05),启动子(0.567%、0.552%、0.556%)、外显子(0.562%、0.556%、0.558%)、内含子(0.561%、0.550%、0.555%)和TSS(0.579%、0.506%、0.621%)的甲基化水平差异均无统计学意义(F=0.37、0.06、0.06、0.16,均P>0.05)。淡色库蚊和骚扰库蚊间筛选出178个差异甲基化位点、4个DMR,淡色库蚊和致倦库蚊间筛选出209个差异甲基化位点、8个DMR,骚扰库蚊和致倦库蚊间筛选出215个差异甲基化位点、11个DMR。GO富集结果显示,DMR相关基因主要富集于对辐射反应、对光刺激反应和对非生物刺激反应等生物过程。致倦库蚊吸血后全基因组甲基化水平从0.602%升高至0.617%,但差异无统计学意义(t=1.21,P>0.05);吸血前1、2、3号染色体的甲基化水平分别为0.569%、0.569%和0.572%,吸血后上升为0.596%、0.597%和0.600%,但差异均无统计学意义(t=1.31、1.33、1.30,均P>0.05);吸血前启动子、外显子、内含子和TSS的甲基化水平分别为0.557%、0.561%、0.560%、0.552%,吸血后上升为0.585%、0.584%、0.584%、0.594%,但差异均无统计学意义(t=1.48、1.35、1.20、1.69,均P>0.05)。致倦库蚊吸血前后基因组间有6个DMR。GO富集结果显示,DMR相关基因在细胞组分上主要富集于内体、囊泡等,在分子功能上主要富集于蛋白结合、小GTP酶结合等。结论淡色库蚊、致倦库蚊、骚扰库蚊全基因组甲基化水平较低,两两亚种间的DMR相关基因主要与对非生物刺激反应生物过程相关。吸血后的致倦库蚊甲基化水平略有升高,吸血前后的DMR相关基因主要和蛋白结合相关。

甲基化特异性多重连接依赖探针扩增技术在胎盘甲基化研究中的应用

目的探讨甲基化特异性多重连接依赖探针扩增技术（methylation—specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA）在胎盘甲基化研究中的可行性。方法应用MS-MI。PA及亚硫酸氢盐测序两种方法对9个正常整倍体胎盘样本及13名非孕妇女外周血进行甲基化检测，并计算候选的CG1149、HLCS、CG1113、ACTB4个基因的甲基化率。结果在13名非孕妇女的外周血标本中，当消化内参完全消化时，ACTB基因的甲基化率波动于0～0．1之间，0．1为MS-MLPA检测甲基化率的截断值；在9个胎盘组织样本中，MS-MLPA与亚硫酸氢盐测序方法所测得的HLCS、CGH13、CG1149和ACTB4个基因的甲基化率结果一致。结论MS-MLPA检测甲基化率结果可靠，可代替亚硫酸氢盐测序用于胎盘的甲基化研究。