中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160病毒株感染性全基因组cDNA克隆的构建与分析

报告了中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆的构建与鉴定.利用RT-PCR方法获得覆盖病毒全长基因组的cDNA片段,以低拷贝质粒pBR322作为骨架,将基因组cDNA置于SP6 RNA聚合酶启动子之后,基因组3'末端带有35个连续的A,通过DNA重组技术组装成病毒基因组全长cDNA克隆.该克隆可在大肠杆菌DH5a中稳定扩增.经体外转录,RNA转录体转染BHK-21细胞,细胞发生病变,恢复病毒滴度达到107～108pFU/ml.全基因组cDNA克隆构建过程中引入的沉默突变(8 453位核苷酸由C变为T)产生Xba Ⅰ酶切位点作为遗传标记,在子代恢复病毒的基因组中稳定存在.从细胞病变的特征、BHK-21细胞的空斑形态、病毒的抗原性、病毒在细胞中的生长动力学特征以及对乳鼠的致病性等方面比较,恢复病毒和亲本病毒XJ-160没有显著区别,提示获得了具有感染性的XJ-160病毒全长cDNA克隆.该病毒感染性全基因组cDNA克隆可以作为反向遗传学系统,为进一步研究病毒复制和致病机制,以及开发相应的载体表达系统提供分子生物学工具.

肠道病毒71型武汉分离株(EV71-WH029)全基因组cDNA克隆及序列分析

目的对肠道病毒71型武汉分离株（EV71-WH029）进行全基因组克隆、序列测定及分析,了解其基因组结构和遗传进化特征,并初步探索EV71毒力相关位点。方法采用RT-PCR扩增覆盖基因组全长的cDNA片段,利用Over-lap extension PCR得到WH029全基因组cDNA克隆;cDNA片段测序后利用BioEdit 4.8.8和MEGA 5.2.2等软件进行序列分析和遗传进化分析;采用Fisher＇s exact test进行编码区氨基酸变异位点的统计分析;采用RNAfold服务器进行非编码区二级结构分析。结果 WH029分离株基因组全长7 406nt（未包含多聚腺苷酸尾）,5′-和3′-UTR分别为743nt和81nt,中间为一个全长6 582nt开放阅读框（ORF）,编码一个长度为2 194aa的多聚蛋白,编码区无核苷酸的缺失或插入;该毒株与安徽阜阳株EU703813及上海株JQ736684的核苷酸及氨基酸序列同源性均最高（分别为97.53%-100%和97.41%-99.73%）,系统进化分析也表明该毒株与以上两株的亲缘关系最近;编码区氨基酸序列分析发现有7个位点变异。非编码区的二级结构预测提示,该区域的核苷酸位点变异与毒力无直接相关性,而与地域有相关性。结论 WH029分离株全基因组结构符合EV71病毒特征,经序列比对及进化分析证实WH029分离株属于EV71C4a基因亚型,并推断该株可能来源于2008年安徽HFMD疫情。对不同临床症状的EV71毒株序列的比较分析提示,EV71毒力与编码区单一位点的突变及非编码区二级结构的变异无直接相关性,可能与多位点突变共同作用及患者的个体差异相关。

牛催乳素基因组及其cDNA全长序列的分子克隆和分析

通过LongPCR等技术首次克隆得到全长 9388bp的牛催乳素 (bPRL)基因组序列 (GenBank登录号AF4 2 6 315 ) ,其中包括bPRL基因全部 5个外显子和 4个内含子 ,5′端 85 4bp的上游调控区以及 3′端 6 9bp的UTR。AF4 2 6 315基因编码的蛋白质在GenBank中的序号为AAL2 80 75 ,由 2 2 9个氨基酸残基组成 ,1～ 30位氨基酸残基为信号肽序列 ,成熟的多肽含有 199个氨基酸残基。将bPRL基因组DNA真核表达载体转染COS 7细胞后通过RT PCR得到长度为80 4bp的bPRLcDNA序列 ,该序列涵盖了bPRL基因的全部ORF区 ,证明本研究所获得的bPRL基因组DNA具有转录的生物学功能。Blast搜索结果显示 ,GenBank数据库中收集有多条bPRL基因的mRNA和EST序列 ,各序列间存在多个SNP位点 ,主要分布于下游编码区和 3′端的UTR ,这些位点均未改变相应的氨基酸残基的性质 ,此外 。

庚型肝炎病毒基因组全长cDNA的拼接及克隆

目的：构建ＧＢ病毒Ｃ／庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）基因组全长ｃＤＮＡ克隆。方法：以覆盖ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ分离株ＨＧＶ－Ｉｗ全长基因组且互相重叠的５个基因片段Ｉｗ５，Ｉｗｑ２，Ｉｗｈ６，Ｉｗ３和Ｉｗ３为起始材料，采用重叠延伸ＰＣＲ拼接和连接酶连接的方法，构建ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ克隆。结果：ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ克隆的酶切图谱与预期一致；核苷酸序列分析显示，克隆的ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ的核苷酸及推测的氨基酸序列与原ＨＧＶ－Ｉｗ序列一致。结论：ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ的克隆已经构建成功。该克隆的构建，为深入研究ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ的致病性及致病机制、复制及转录和翻译机制。

猪瘟病毒兔化弱毒(HCLV)疫苗株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

根据猪瘟病毒基因组的序列设计合成了覆盖HCLV基因组全部序列的5对引物,通过RT-PCR从感染家兔脾脏中扩增获得了包含HCLV(bog cholera lapinized virus,HCLV)基因组全序列的5个cDNA片段,并将它们分别克隆至pGEM-T vector中。然后将这5个cDNA片段按它们在HCLV基因组上的位置从5’端至3’端的顺序依次通过酶切连接,一并克隆到pPoly2载体中得到HCLV基因组全长cDNA的质粒pPOHCLV。序列分析表明,HCLV基因组长度共12310bp,有一个大的ORF,编码一3898个氨基酸的多聚蛋白。其5'-NCR和3’-NCR长度分别是374nt和239nt。与非兔化毒株相比较,HCLV基因组在12133nt处有12个碱基的插入CTTTTTTCTTTT,该序列可能是病毒在适应兔体增殖过程中形成的。基于基因组全序列及其所推导的氨基酸序列的同源性分析表明,毒株的亲缘关系的远近与它们的毒力之间并没有相关性。

传染性法氏囊病病毒浙江分离株(ZJ2000)基因组A节段全长cDNA的克隆和序列分析

以传染性法氏囊病病毒 (IBDV )浙江分离株 (ZJ2 0 0 0 )基因组 RNA为模板 ,采用 L ong- accurate RT- PCR(L A-PCR)一步法扩增并克隆了 IBDV ZJ2 0 0 0株基因组 A节段全长 c DNA。序列测定结果表明 ,克隆的 A节段全长共32 5 9个核苷酸 ,包括 5′、3′端的非编码区 (NCRs)和 2个部分重叠的开放阅读框 (ORF1和 ORF2 ) ,与参比的血清 型毒株核苷酸序列的同源性高达 95 .2 %～ 99.2 %。二级结构预测表明 ,在 5′- NCRs和 3′- NCRs存在 1个大型的茎环发夹结构。 ORF2编码 14 5个氨基酸的 VP5 ,与参比毒株的同源性高达 98.6 %～ 10 0 %。 ORF1编码 10 12个氨基酸的VP2 / VP4 / VP3,在氨基酸水平上 VP2、VP3、VP4与参比毒株的同源性分别达 94 .9%～ 98.8%、96 .1%～ 98.5 %、97.1%～ 99.2 %。ZJ2 0 0 0共有 14～ 38个氨基酸的替代 ,其中特有氨基酸 6个 ,变异大多数集中在 VP2高变区 ,突变率达 2 .9%～ 11%。第 2个小亲水区内 2 80位氨基酸由 S替代了 N、2 90位 M替代了 L。这 2个突变可能与 IBDV的抗原性有关。VP2 - VP4剪切位点附近 5 11和 5 4 0位氨基酸的变异可能使 ZJ2 0 0 0株的毒力增强。分子系统进化树分析表明 ,ZJ2 0 0 0与欧洲 Cu- 1株、P2株、CEF94株和中国 Harbin株的关系最近 ,而与欧洲、香港、?

丙肝病毒全基因组cDNA克隆侵染细胞培养体系的建立

以含有丙肝病毒全基因组cDNA的重组质粒(pHCV)为材料,通过基因转染、重组痘病毒辅助使之在HeLa细胞中表达HCV病毒体,建立了一种新的HCV体外细胞培养系统.采用RT-PCR,荧光定量RT-PCR,链特异性RT-PCR,免疫印迹,免疫电子显微镜和电子显微镜负染技术跟踪检测HCV的增殖效率,结果显示,该培养体系中有HCV正链RNA的合成和HCV结构蛋白、非结构蛋白的表达,并组装成直径约47nm的HCV病毒体,病毒体可被偶联有胶体金的抗HCV结构蛋白E2的单抗标记;该体系产生的HCV病毒体滴度达107基因拷贝/mL,远远高于病人血清中的HCV基因拷贝数,也高于迄今报道的任何一种HCV细胞培养体系的病毒滴度.检测结果证明,转染细胞裂解上清中的HCV病毒体可以感染肝癌细胞系Huh7,并在感染细胞中增殖和合成负链RNA中间体,病毒滴度达106基因拷贝/mL.

LA-PCR快速克隆传染性法氏囊病病毒基因组A节段全长cDNA方法的建立

从浙江省某鸡场暴发疑似传染性法氏囊病 (IBD)的法氏囊病料中分离到 1株致死率高达 70 %的强毒株 (IBDV-ZJ2 0 0 0 )。通过筛选 ,采用效果最理想的蛋白酶 K法从法氏囊中提取病毒基因组 RNA,经 L i Cl纯化后 ,优化各种反应参数和条件 ,建立了 L ong- accurate PCR(L A- PCR)一步直接扩增 IBDV A节段全长 c DNA的方法 ,得到一约 3.2 6 kb的片段。L A- PCR法能快速从病鸡法氏囊和细胞适应毒中扩增 A节段全长 c DNA,为研究各 IBDV毒株 A节段的结构和功能打下了基础。

水稻黑条矮缩病毒基因组片段S7的cDNA克隆及全序列分析

应用RT PCR技术克隆了 2个水稻黑条矮缩病毒 (riceblack streakeddwarfvirus,RBS DV)中国分离物 ,即浙江分离物和河北分离物的基因组片段S7,并测定了他们的全序列。结果表明 :RBSDV浙江分离物 (RBSDV Zj)基因组片段S7全长 2 1 93nts(EMBL登录号为AJ2 9742 7) ,RBSDV河北分离物基因组片段S7全长 2 1 90nts(EMBL登录号为AJ2 9742 8) ,二者均含有两个开放阅读框 (openreadingframe,ORF) ,分别编码约 41kD和 3 6kD多肽 ,2个中国分离物核苷酸同源性高达 99% ,相应的ORF编码的多肽同源性分别为 1 0 0 %和 94 4% ,与日本RBSDV基因组片段S7核苷酸同源性为 93 4%和 93 8% ,相应ORF编码的多肽同源性分别为98 1 % (ORF1 )、96 5 %和 97 8% (ORF2 ) ,与意大利MRDVS6核苷酸同源性为 85 1 %和85 3 % ,相应多肽同源性分别为 92 3 % (ORF1 )、85 5 %和 86 8% (ORF2 )。

中国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长cDNA克隆及序列测定

从中国人源蓝氏贾第虫北京株 ( BEIJ88/ BTMR1/ 1)体外纯培养的电镜负染和超薄切片观察到蓝氏贾第虫病毒粒子。该病毒位于感染早期贾第虫的细胞质中 ,感染晚期的细胞核中。根据国外发表的蓝氏贾第虫病毒序列设计了 6对互相重叠的引物。用这 6对引物对从中国人源蓝氏贾第虫北京株发现的蓝氏贾第虫病毒基因组进行 RT- PCR,将产物连接到 p MD18- T载体中并转化入 DH5 α感受态菌 ,送上海生工测序 ,通过 BL AST对 Gen- Bank进行同源性搜索。结果测得我国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长为 6 2 73bp,与国外报道的蓝氏贾第虫病毒序列同源性为 95 % ,编码的氨基酸同源性为 90 %。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株基因组全长cDNA克隆的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)嗜好在PAM和其他单核细胞上生长 ,如果把PRRSV作为一种病毒活载体 ,它就可以携带外源抗原高效进入猪体的免疫系统 ,更好地刺激机体产生免疫应答。本实验根据PRRSV基因组和克隆载体的限制性内切酶酶切位点 ,将PRRSV基因组设计为 8段进行了反转录和扩增 (RT_PCR) ,将得到的片段克隆到质粒pBluescriptIISK(_)或pMD 18T_vetcor中。在扩增 5’端时 ,运用 5’RACE获得了基因组 5’最末端序列 ,在亚克隆入pOK12前在 5’端上游引入了T7启动子序列。选取一个克隆在 3’端紧挨ORF7下游引入了PacⅠ位点 ,以期作为感染性分子克隆的分子标志。将扩增片段在pBuescriptIISK(_)中进行了部分连接后 ,亚克隆于低拷贝质粒pOK12中 ,在pOK12中进行了长片段的连接 ,并获得了基因组全长cDNA克隆。进行全基因测序后 ,在 3处发现有 6个核苷酸的缺失 ,运用插入突变修补丢失的碱基 ,最终获得了含有PRRSVCH_la株基因组全长cDNA的重组质粒pOKCH_laF和含有分子标志PcaⅠ的基因组全长cDNA克隆pOKCH_laPacIF。在本试验中构建的基因组全长cDNA克隆为进一步获得具有感染性的PRRSV分子克隆并研究该病毒基因组结构和功能奠定了基础。

欧洲型PRRSV弱毒株全长基因组cDNA克隆的构建与分析

为了获得欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,通过RT-PCR技术扩增了AMERVAC-PRRS/A3弱毒株的全基因组,并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果,选择合适的酶切位点将各个亚克隆产物逐段克隆入改造过的pBluescriptⅡKS(+)载体中,从而获得了病毒的全长基因组cDNA克隆。测序结果表明,该弱毒株基因组序列全长为15 098 bp(不包括poly(A)尾)。同源性比较结果显示,Ningbo42株ORF7基因(EF473137)、FJ0603株Nsp2基因(EF592535)与该弱毒株的相应基因之间的同源性分别为100%和98%。这些数据暗示,国内欧洲型PRRSV Ningbo42株和FJ0603株的存在与欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3密切相关。测序及酶切鉴定结果表明,欧洲型PRRSV全长基因组cDNA克隆已构建成功。

基因组研究中全长cDNA克隆的策略

全长cDNA的克隆是目前人类基因组研究中的一个重要方面 ,与大规模基因组测序相比较 ,cDNA测序克隆用相对较少费用获得更多的功能基因信息 ,故也是符合我国国情的基因组研究的主要方向。如何更加高效地获得新的全长cDNA ,本文结合作者自己工作中的经验 ,对从全长文库的建立到全长cDNA的测序及克隆方法作了较为详细的介绍。

鸭圆环病毒全基因组克隆与序列分析

为研究鸭圆环病毒全基因组的分子生物学特性,运用重叠PCR技术从鸭组织脏器提取的DNA中扩增出2条核苷酸序列,拼接后对其核酸组成、基因组结构及病毒的遗传变异进行分析。结果表明所获病毒核酸为大小1995nt的环型DNA,包含6个ORF,与登录在GenBank中克隆株MuDCV(AY228555)的同源性高达97·4%,可见所扩增的核酸序列为鸭圆环病毒基因组序列。

猪乙型脑炎病毒SH0601株基因组序列分析及全长cDNA的构建

目的对猪源乙型脑炎病毒SH0601株进行全序列测定与分析,以了解该株病毒的遗传特征,并构建全长cDNA克隆。方法将猪源JEV SH0601株基因组RNA分5段进行RT-PCR并克隆入pCRⅡ-Blunt-TOPO和pBluescript载体中,测定了全长cDNA序列。根据cDNA克隆酶切图谱分析,将5个片段先后克隆入pBluescript中构建JEV全长基因组cDNA。根据E蛋白基因序列对SH0601株进行了遗传分型。结果序列分析表明:SH0601株基因组全长10977nt,与GenBank中的Beijing-1、P3、SA14和SA14-14-2株基因组全长相比,在3′NTR的10701nt处多一碱基"G",与上述4株病毒的全长核苷酸的同源率都达97.2%以上,而与国外猪源分离株KV1899和JEV/sw/Mie/41/2002全长核苷酸的同源率仅达88.7%,但SH0601株与6株病毒的全长氨基酸同源率均达97.0%以上。以E蛋白基因序列对SH0601作进化分析,该分离株属基因型Ⅲ型。结论SH0601株属于乙型脑炎病毒基因Ⅲ型。在高拷贝质粒pBluescript中可构建稳定的乙型脑炎病毒全长cDNA克隆。

A组人轮状病毒全基因组克隆和基因型分析

运用基因克隆和重组技术,从一急性胃肠炎患儿样品中克隆到一株轮状病毒(RV)全基因组cDNA。核苷酸序列测定结果表明,该株RV基因组11条RNA共含有18613个核苷酸(3302bp^751bp),编码5791个氨基酸。全基因组研究结果表明,该株RV(TB-Chen)为A组,II亚组,基因型为G2P[4]/NSP4[A]。这是首个A组人RV全基因组研究结果的报道,对研究和开发RV疫苗具有积极的意义。

猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒 (porcinecircovirustype 2 ,PCV - 2 )全基因组序列 ,设计一对PCV - 2特异性引物 ,用该室分离的PCV - 2豫A株感染PK - 15细胞 ,从中提取PCV - 2复制型基因组DNA ,并以之为模板进行PCR扩增。回收PCR产物 ,构建重组测序质粒T -PCV - 2。测序结果表明 ,猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组为 176 7bp ,与GenBank收录的PCV - 2国外分离株核苷酸的同源性可高达 97%。序列分析表明 ,复制型豫A株的基因组包含 10个读码框架 ,其中ORF1、ORF2是其两个最主要的读码框架 ,分别编码 314、2 34个氨基酸。豫A株和PCV - 1间的ORF1、ORF2的氨基酸序列同源性分别为 85 %、6 6 % ,与其它PCV - 2毒株间的ORF1氨基酸同源性均在 98%以上 ,而ORF2的氨基酸同源性为 92 %～ 97%。

猫杯状病毒全基因组的克隆及序列分析

采用RT-PCR和重组PCR扩增了猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)CH-GD株的全基因,并进行了序列测定,用DNAStar软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比较分析。结果表明,首次分离于中国广东的CH-GD株与各参考毒株有较大的差异。CH-GD株与各参考毒株之间的同源性仅为75.4%~77.1%,明显低于各参考毒株之间的同源性(78.9%~99.9%)。同时遗传进化树显示,14个分离株形成两大分支,CH-GD株独自在一分支,各分离株无明显的地域性差异。对FCV衣壳蛋白6个区(A^F)的分析结果发现,CH-GD株中A^F区的特点与报道的相符。此外还发现,CH-GD株有3个区域的3个连续的氨基酸发生了变异,与参考毒株相比,CH-GD株在这3个区域的抗原性和亲水性也都发生了相应的变化。

在MDCK细胞上高产的乙型流行性感冒病毒株的筛选及其全基因组克隆

流行性感冒(流感)病毒可引起世界范围的大流行,因此需要及时地生产流感疫苗来预防流感的流行。乙型流感病毒是疫苗的重要组成部分。传统制备疫苗的方法是使用鸡胚生产,存在很多缺陷,应用哺乳动物细胞生产流感疫苗是个更好的选择。但是,乙型流感病毒感染MDCK细胞后,很难得到持续的高产。此实验筛选到的乙型流感病毒在MDCK细胞连续传代15代后,PFU值从第1代的8×104到第15代2×109,TCID50从第1代6 5到第15代的8 0。将筛选到的毒株进行全基因组克隆,用两套引物获得乙型流感病毒的全部8个节段。此结果为利用反向遗传技术将高产毒株与流行毒株重配,进而在哺乳动物细胞上生产基因工程流感疫苗打下基础。

鸡传染性贫血病毒广西株全基因组的克隆与序列分析

为了解鸡传染性贫血病毒（CIAV）广西分离株全基因变异情况,设计3对特异性引物,对CIAV广西分离株（GXC060821）的全基因进行PCR扩增、克隆和序列分析。结果显示,广西分离株的全基因为2 292个核苷酸,含有3个互相重叠的开放阅读框（ORF）。序列分析表明,本CIAV分离株与国内外其他31个CIAV毒株比较核苷酸的同源性在96.1%~98.5%之间,推导氨基酸的同源性在89.8%~94.2%之间。全基因系统发育进化树分析显示,广西分离株和中国的TJBD40株、LF4株都处于一个分支,它们的亲缘关系较近,而与美国的98D06073分离株及中国的HA4分离株的亲缘关系较远。