全外显子测序技术检测在原发性免疫缺陷病诊断中的应用

全外显子测序(WES)技术因相对经济有效,已被广泛应用于临床疾病的基因诊断中。本文主要探讨WES在原发性免疫缺陷病(PID)临床诊断中的应用,系统总结了在WES检测辅助下找到的PID的致病基因以及新发现的致病基因,并将其分为转录因子相关基因和非转录因子相关基因两大部分。希望能为临床基因诊断提供帮助。

系统胎儿超声联合全外显子测序技术诊断胎儿四肢骨骼发育异常的价值

目的:探究系统胎儿超声检查联合全外显子测序(WES)对染色体微阵列(CMA)分析正常,但四肢骨骼发育异常胎儿产前诊断价值。方法:选择2021年3月-2022年1月本院产前妊娠11^(+1)~13^(+6)周时超声提示胎儿颈项透明层(NT)≥3.5mm,行G显带染色体核型分析(KA)、CMA未见明显异常进行WES检测孕妇76例,孕16~18周行系统胎儿超声检查,收集其CMA检测、妊娠结局等资料,分析系统胎儿超声检查联合WES在胎儿四肢体骨骼发育异常中的诊断价值。结果:系统胎儿超声检测结果显示,14例(18.4%)骨骼结构畸形,包括5例多指、3例并趾、3例桡骨短小、2例缺趾、1例足内翻,均终止妊娠且引产证实骨骼系统和肢体异常。WES检出阳性(检出致病性或可能致病性的基因变异)15例(19.7%),以成骨发育不全和软骨发育不全最为常见。以上突变经过Sanger测序予以验证,其中8例胎儿为常染色体显性遗传,突变来源均为新发突变,主要涉及到COL1A1、COL1A2、FGFR3基因;4例胎儿为常染色体隐性遗传,突变来源为父亲或者母亲,3例胎儿突变来源不明。15例胎儿中12例在妊娠16~18周超声发现四肢骨骼异常,3例未发现其他异常,其中13例引产终止妊娠,2例继续妊娠(1例出生后足内翻、1例随访到6月龄发现矮小症);61例WES阴性胎儿中,2例系统超声显示骨骼畸形,59例妊娠16~18周及中晚期超声检测均未发现异常,其中1例终止妊娠,余58例继续妊娠直到分娩,随访至6月龄四肢骨骼生长发育均正常。结论:胎儿系统超声联合胎儿WES技术,可对染色体正常但四肢骨骼发育异常的胎儿进行有效产前诊断,减少孕妇等待时间。

全外显子测序技术诊断Sheldon Hall综合征

目的:应用全外显子测序技术(whole exome sequencing,WES)辅助临床诊断2例远端关节弯曲Sheldon Hall综合征家系,为患者遗传咨询和产前诊断提供依据。方法:收集临床资料,提取患者及家系成员外周血基因组DNA,采用外显子捕获技术进行检测,结合生物信息学软件及数据库进行分析,根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG,2015)标准对检测出的变异进行致病性判定,结合患者临床表型寻找致病基因及位点,最后经Sanger测序法对致病位点进行验证。结果:家系中2例患者TNNI2基因第8号外显子均存在杂合突变(c.525_c.527delGAA,p. 176delK),为常染色体显性遗传,生物信息学分析为致病性突变,Sanger测序验证结果与外显子捕获测序结果一致。结论:应用全外显子测序技术对远端关节挛缩畸形的患者进行诊断,明确致病原因,为家系遗传咨询和产前诊断提供指导。

基于全外显子组测序对病因不明致死性胎儿水肿遗传学病因的初步分析

目的针对不明原因致死性胎儿水肿的患儿行全外显子组测序,分析与胎儿水肿表型相关的潜在候选基因。方法收集2011年1月1日至2017年6月1日复旦大学附属儿科医院(我院)收治的不明原因致死性胎儿水肿并行全外显子组检测的病例,采集与致死性胎儿水肿有关的母亲、围生期和新生儿因素,按照我院转化医学中心建立的高通量测序数据分析流程,采用Ex AC数据库、千人基因组数据库和我院分子诊断中心已经进行建立的13 810例全外显子组数据,行后续数据分析。结果符合本文纳入标准的不明原因致死性胎儿水肿患儿18例进入本文分析,男、女各9例,胎龄(34±2)周,体重(2 935±911)g。2例患儿母亲有因胎儿水肿或胸腔积液引产的不良孕产史,3例患儿为试管婴儿。常见的临床表型除胎儿水肿和羊水过多外,还包括心功能不全、休克和肺发育不全等。7例患儿检测到符合罕见潜在致病标准的变异共9个。5例患儿检测到的杂合变异,2个为有害变异(无义变异位于FOXF1基因,移码变异位于RASA1基因),3个错义变异(位于FOXC2基因)。2例患儿检测到的杂合变异,4个变异位于PIEZO1基因2个均为有害变异,位于DSP基因的2个变异均为错义变异。上述基因进行通路富集分析发现,多集中在心血管、血管和血管内皮生长因子等通路上。结论在病因不明的致死性胎儿水肿病例中检测到罕见潜在致病变异,结合既往报道文献,FLT4、SPTB、PIEZO1和FOXC2基因可考虑作为胎儿水肿候选基因;首次提出FOXF1、RASA1和DSP基因可能与胎儿水肿表型相关。

全外显子测序产前诊断Walker-Warburg综合征

目的利用全外显子测序技术对患有脑积水和先天性心脏病的胎儿进行产前诊断,并指导再次妊娠。方法提取胎儿羊水细胞DNA以及父母外周血DNA,采用外显子测序技术进行检测,经过建库、杂交捕获、测序等过程,将得到的数据经过比对、软件分析、查找数据库及文献等,根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG,2015)原则寻找胎儿的致病基因,并利用Sanger测序对致病位点进行验证。结果全外显子测序技术检测结果发现患儿POMT1基因发生复合杂合突变,分别遗传自母亲的经典剪切位点突变c.605+1G>A(IVS7)和遗传自父亲的移码突变c.1367_c.1368(exon 15)ins GA,p.L456Lfs*80;Sanger测序验证结果与外显子捕获测序结果一致。胎儿为Walker-Warburg综合征患者。胎儿父母最终决定终止妊娠。结论利用全外显子测序技术可快速可靠地诊断Walker-Warburg综合征患者,在临床决策及产前咨询中发挥重要作用。

全外显子组测序诊断由TCOF1基因变异所致的Treacher-Collins综合征一个家系

目的通过全外显子组测序(WES)探讨1个Treacher-Collins综合征(TCS)家系的遗传学病因。方法回顾性分析2020年2月5日于青岛大学附属妇女儿童医院就诊的1个TCS家系的临床资料,运用WES对先证者进行基因检测,对候选变异进行生物信息学分析,并通过Sanger测序进行家系验证。结果WES检测显示先证者携带TCOF1基因c.3337C>T杂合变异,Sanger测序显示其母亲和弟弟携带同样的杂合变异。依据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)相关指南,该变异评定为致病性(PVS1+PM2_Supporting+PP4)。结论TCOF1:c.3337C>T可考虑为该TCS家系患病成员的致病原因。

全外显子组测序技术在新生儿遗传病诊断中的应用

新生儿期的遗传病往往具有临床症状不典型、病情较为严重等特点,从而造成诊断和治疗的困难。随着测序技术的不断发展,第二代测序技术以其高通量、低成本、快速化检测等优势逐渐应用于临床领域。全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)技术作为第二代测序技术的一种,仅对基因组外显子区域进行序列捕获、富集并测序,再利用生物信息学手段对WES产生的大量数据进行分析和筛选,从而找到遗传病的变异基因或位点。WES技术因其具有检查结果提示全面和报告周期短的优势,逐渐成为新生儿遗传病分子诊断的重要手段。

全外显子测序技术在癫痫患儿致病基因检测中应用价值

目的应用全外显子测序技术对2例癫痫患儿进行基因检测以明确诊断,探讨全外显子测序技术对癫痫的基因诊断价值。方法分别提取2例癫痫患儿(患儿1、2)及其父母的外周血DNA,采用全外显子测序技术对其进行基因检测,采用Sanger测序法对2例患儿及其父母的可疑致病基因变异进行验证。明确病因后,分别抽取2例孕妇(患儿母亲)的羊水,提取胎儿DNA,采用Sanger测序法进一步对胎儿进行产前诊断。结果患儿1 SCN2A基因存在c.4399C>G错义杂合变异,其父母该位点均为野生型,胎儿该位点也为野生型,其父母选择继续妊娠;患儿2 TBC1D24基因存在c.76G>T和c.1595C>G复合杂合变异,分别遗传自其父母,胎儿为c.76G>T杂合变异携带者,其父母选择继续妊娠。结论 TBC1D24基因c.76G>T和c.1595C>G复合杂合变异、SCN2A基因c.4399C>G杂合变异可能是癫痫患儿的致病原因,全外显子测序技术可快速、准确地对癫痫进行基因诊断。

400例性发育异常患者遗传学病因检测与特征分析

目的应用多种遗传学技术检测诊断400例性发育异常(DSD)患者的遗传学病因,并总结分析其临床特征。方法选取2018年1月至2023年3月该院收治的400例确诊为DSD的患者作为研究对象,运用G-显带染色体核型分析、荧光原位杂交(FISH)、多重链接探针扩增技术(MLPA)、高通量测序的低深度全基因组测序(CNV-seq)、全外显子组测序技术(WES)、全基因组测序(WGS)等技术进行检测和定位,查找患者遗传学病因。结果经G-显带染色体核型分析,以及FISH、MLPA对核型分析结果进行验证,明确诊断45,X特纳综合征及其变异型136例(34.00%),47,XXY克氏综合征及其变异型187例(46.75%);经G-显带染色体核型分析、CNV-seq、WES、WGS、一代测序技术诊断46,XX DSD 17例(4.25%)、46,XY DSD 35例(8.75%);经G-显带染色体核型分析和FISH、MLPA验证诊断性染色体核型异常DSD 25例(6.25%)。结论联合应用G-显带染色体核型、FISH、CNV-seq、WES等多种遗传学方法,能准确发现DSD的遗传学病因,建立基因型与表现型之间的良好关系。

一例家族性颅内海绵状血管瘤基因新突变位点报道及文献复习

目的:对一例家族性颅内海绵状血管瘤(FCCM)家系进行临床诊断、治疗及遗传学分析,并复习相关文献。方法:对先证者及其亲属收集临床资料及应用全外显子组测序(WES)技术进行基因分析。结果:先证者及其大儿子临床诊断为FCCM,且先证者合并皮肤血管畸形,其CCM1/KRIT1基因均发现c.1307_1308insT的杂合核苷酸变异,该变异导致从第436号氨基酸亮氨酸(Leu)开始的氨基酸合成发生改变,并在改变后的第6个氨基酸终止(p.Leu436PhefsTer6),为移码变异。其他无症状的家族成员,均未见该基因突变。该位点突变在之前未见报道。先证者为双侧颞叶海绵状血管瘤,治疗相对困难,经两次手术后疗效欠佳,仍需密切随访。结论:FCCM患者CCM1/KRIT1基因有新的突变位点;先证者临床表现除顽固性癫痫发作外,合并CCM1基因突变导致的皮肤血管畸形;先证者表现为多发海绵状血管瘤(CCMs),双侧颞叶为可疑致痫灶,经两次手术治疗后效果欠佳。

一家系遗传性多发性骨软骨瘤的致病突变基因鉴定

目的鉴定一家系遗传性多发性骨软骨瘤(HME)的致病突变基因。方法抽取该家系先证者及家系成员外周血,进行血液常规及生化项目检查,提取基因组DNA,应用全外显子组测序技术进行检测,通过生物信息学分析筛选致病变异,确定突变位点,用PCR-Sanger测序法进行突变验证。结果该家系5例患者均存在EXT1基因第6外显子c.1468dupC(p.Leu490Profs*31)杂合移码突变,表型正常家系成员未检测到该突变,符合家系基因型—表型共分离。结论导致该家系患者发病的致病突变为EXT1基因c.1468dupC(p.Leu490Profs*31)杂合移码变异,该结果进一步扩展了EXT1基因的突变谱,同时也为家系中患者的遗传咨询和产前基因诊断奠定了分子基础。

GNB1基因突变致神经发育障碍患儿的临床及基因突变分析

目的:应用全外显子测序技术(whole exome sequencing,WES)对患有语言运动发育迟缓及严重智力障碍的患儿及其父母进行分析,探讨基因水平的遗传学病因并明确临床诊断,进一步指导妊娠。方法:提取患儿及其父母外周血DNA,采用外显子捕获结合高通量测序技术进行检测。根据美国医学遗传学与基因组学学会标准对患儿及父母检测出的变异进行致病性判定,结合患儿表型寻找致病基因及位点。利用Sanger测序法对致病位点进行验证。结果:患儿GNB1基因第7号外显子c.346 G>A(p.G116S)位点杂合错义突变为致病位点,患儿父母该位点均为野生型,此变异为患儿的新发突变。Sanger测序验证结果与外显子捕获测序结果一致。患儿为常染色体显性智力低下42型(autosomal dominant mental retardation-42,MRD42)患者。结论:应用全外显子测序技术对语言运动发育迟缓伴严重智力低下的患儿进行诊断,可明确患儿的致病原因,有助于家系的遗传咨询并为再生育提供指导。

全外显子组测序对先天性泌尿系统发育异常胎儿的致病性检出率分析

目的观察先天性泌尿系统发育异常(CAKUT)胎儿致病性应用全外显子组测序技术(WES)的检出率.方法筛选2019年1月~2020年3月我院妇产科收治的的100例产前超声提示CAKUT病例;根据是否合并其他系统异常分组,A组74例单纯CAKUT病例,进行WES检测;B组26例CAKUT合并其他系统异常,进行核心家系WES检测.测序操作流程严格依照Hiseq 2500标准进行,A组测序周转时间11~12周,B组测序周转时间8~9周,数据处理分析用相应数据库与生物学信息软件.结果本研究对100例超声提示CAKUT病例进行WES检测,结果显示,检测出致病性突变病例15例,涉及基因为BBS2、HNF1B、NEK8、UMOD;可能致病性突变7例,涉及基因GRIN2B、HSPD1.在CAKUT病例中,WES的阳性检出率为22.00%(22/100);本组22例阳性样本中,CAKUT合并其他系统异常检出率为57.69%(15/26),单纯CAKUT病例中阳性检出率为9.46%(7/74).结论产前对超声提示可能出现CAKUT病例进行WES检查,能提高对不明原因的CAKUT胎儿致病性检出率,临床值得推广.

PRRT2 c.649C>T突变导致智力障碍以及蛋白质表达异常

目的利用全外显子测序技术寻找1例智力障碍合并癫痫及运动障碍患者的遗传学病因,并探究其致病机制。方法提取患儿及父母双方的外周血DNA,使用外显子测序技术寻找患儿的致病基因,并使用Sanger测序验证致病位点。利用小鼠cDNA诱导克隆该致病基因并构建质粒,采用western blot检测致病基因蛋白与野生型蛋白的表达情况。结果全外显子测序检测发现该患者PRRT2基因存在无义突变(c.649C>T;p.R217X),遗传自母亲;Sanger测序验证结果与外显子捕获测序结果相一致。western blot证实小鼠PRRT2 R223X突变蛋白(对应人PRRT2 R217X)不能正常表达。结论PRRT2基因c.649C>T突变可能是该例患者智力障碍的致病原因。突变的PRRT2 R217X蛋白不能正常表达。

一例青少年型神经元蜡样脂褐质沉积症的基因诊断

目的对一例青少年型神经元蜡样脂褐质沉积症(JNCL)的患者进行临床诊断和遗传学分析,为阐明JNCL遗传机制提供线索和方向。方法对患者进行临床诊断和家系分析,提取患者及其父母DNA,通过全外显子组测序(WES)技术对患者进行基因突变分析,同时对患者及其父母进行Sanger测序验证、突变致病性分析和蛋白序列同源性比对。结果 CLN3存在c.1001G>A(p.Arg334His)和c.154T>C(p.Tyr52His)复合杂合突变,分别遗传其父亲和母亲,突变致病性分析均为有害和致病,蛋白序列同源性比对中同源区域均为高度保守。结论患者可能是由CLN3复合杂合突变导致的青少年型神经元蜡样脂褐质沉积症,其中c.154T>C(p.Tyr52His)位点突变尚未见报道。全外显子组测序技术可作为发现JNCL的诊断手段,可为临床表型复杂的疾病确诊提供依据。

16p11.2微缺失相关儿童癫痫的临床表型与遗传学特征分析

目的探究16p11.2微缺失相关儿童癫痫的临床表型与遗传学特征。方法回顾性收集200例应用全外显子测序技术进行癫痫遗传学分析的癫痫患儿,其中9例癫痫患儿为16p11.2微缺失,分析9例16p11.2微缺失患儿的临床表型及遗传学特征。结果16p11.2微缺失检出率为4.5%(9/200)。9例患儿为3~10月龄的婴儿;癫痫发作形式为局灶运动性发作伴意识障碍,部分进展为全身强直-阵挛发作;发作间期脑电图为局灶或多灶性痫样放电,对抗癫痫药物反应良好。9例患儿16p11.2缺失片段大小在398~906 kb之间,缺失基因数为23~33个,且均为致病性变异,其中2例为母源性来源,1例为父源性来源,余均为新发变异。结论16p11.2微缺失在癫痫患儿中有一定的检出率,16p11.2微缺失多为新发变异,且为基因大片段缺失;16p11.2微缺失相关儿童癫痫多在出生1年内起病且为药物反应性癫痫。

一例X-连锁无丙种球蛋白血症患者BTK基因新变异体的鉴定

目的对一例X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)患者进行致病基因变异鉴定。方法收集患者及家庭成员临床资料并采集外周血,从患者外周血中提取基因组DNA并进行全外显子组测序,筛查可疑致病变异,并对其父母基因组DNA进行Sanger测序验证及基因型-表型共分离分析,从患者外周血中提取RNA,反转录为cDNA后进行Sanger测序,同时进行实时定量PCR实验检测该基因表达水平,进而对该变异的致病性和致病机制进行分析。结果患者携带BTK基因c.240+3A>C新变异,该变异遗传自母亲,在家系中呈基因型-表型共分离,该变异体在dbSNP153、ExAC、gnomAD和HGMD等公共数据库未见报道。该变异属于剪接变异,cDNA测序显示该变异造成BTK基因3号内含子5′端106 bp碱基插入到第3号和第4号外显子之间,引起阅读框改变,最终导致终止密码子提前出现。患者BTK基因mRNA表达水平明显降低。结论BTK基因c.240+3A>C处剪接变异可能导致该患者患X-连锁无丙种球蛋白血症。

基于基因检测诊断晚婴型神经元蜡样脂褐质沉积症1例

对1例晚婴型神经元蜡样脂褐质沉积症(LINCL)患儿进行临床诊断和遗传学分析。该患儿TPP1存在c.1424C>T(p.Ser475Leu)和c.962A>G(p.His321Arg)复合杂合突变,分别遗传其父亲和母亲,突变致病性分析均为有害和致病,蛋白序列同源性比对中同源区域均为高度保守。患儿可能是由TPP1复合杂合突变导致的晚婴型神经元蜡样脂褐质沉积症,其中c.962A>G(p.His321Arg)位点突变尚未见报道,新突变基因的发现扩大了该基因的突变谱,为阐明LINCL遗传机制提供线索和方向。全外显子组测序技术(WES)可作为发现LINCL的诊断手段,可为临床表型复杂的疾病确诊提供依据。

WDR34基因突变致窒息性胸廓发育不良1例报道并文献复习

窒息性胸廓发育不良(ATD)是一种常染色体隐性遗传非致死性骨骼发育不良病,又称Jeune综合征,其主要临床表现为胸廓狭窄,肋骨短、直,四肢短小、骨盆发育畸形并可累及全身多器官发育不良[1]。ATD的发病率极低,仅为1/130 000~1/10 000,到目前为止,我国仅有少数个案报道,临床医生对本病的认识不足,容易导致漏诊或误诊[2]。因此,本研究报道1例ATD的临床表现,并回顾性分析国内报道的个案,总结其临床特点、诊疗情况及预后,以提高临床医生对本病的认识。

锌指基因家族与乳腺癌转移的相关性研究

目的:用全外显子测序技术筛选与乳腺癌转移的相关基因;方法:通过外显子测序技术对1例转移性乳腺癌的原发肿瘤组织及转移组织分别进行全外显子测序。结果:发现杂合性缺失涉及的基因最多的是19号染色体,统计发现位于该区域的锌指基因家族的杂合性缺失发生率最高,涉及基因26个,主要集中在19p13及19q13上。结论:19号染色体上锌指基因家族的的杂合性缺失可能与乳腺癌的转移密切相关。