全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术在重组蛋白疫苗电荷异质性分析中的应用

重组蛋白分子表征的稳定性是保证疫苗发挥免疫原性及抗原性的关键。重组蛋白疫苗与治疗性蛋白制品一样,因体外合成和纯化过程的复杂性而表现出异质性。其中,电荷异质性是重组蛋白质的关键质量属性之一。电荷异质性监测有助于推动生产工艺的优化,反映产品生产的一致性和稳定性等,对保证重组蛋白产品的安全和质量至关重要。开发可靠快速、灵敏稳健的电荷异质性分析方法一直是生物制药行业所追求的目标。经典的电荷异质性分析方法主要有离子交换色谱(IEC)、毛细管区带电泳(CZE)以及全柱成像毛细管等电聚焦电泳(WCID-CIEF)等,其中WCID-CIEF提供的等电点(pI)和峰形的生化指纹有助于对疫苗多蛋白成分的分析。基于以上该文将对WCID-CIEF的原理和特点及其在重组蛋白疫苗质量控制中的应用进行概述。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析蛋白质药物电荷异质性

评价了cIEF-WCID检测多肽与蛋白质药物等电点的应用效果。测定标准多肽的等电点,验证了cIEF-WCID具有高的准确度和良好的重复性(相对标准偏差<0.50%)。人血红蛋白的4种主要异构体实现了基线分离;甘赖胰岛素的重复测试均只检出单一特征峰(p I 5.95±0.01);比较重组人生长激素原液和成品,等电点特征峰比例差异明显,且成品有新特征峰出现;对比进口及国产贝伐单抗,发现厂家1、3与原研药基本一致,厂家1的主成分迁移规律与原研药高度一致,厂家2的重链C末端K缺失、N末端焦谷氨酸环化或脱酰胺修饰影响了电荷异质性;通过考察尿素浓度、电解质范围和聚焦时间,优化了检测重组人促卵泡素等电点条件:2 mol/L尿素,两性电解质pH 2.5~5.0与pH 3.0~10.0按1∶1混合,聚焦电压1 000 V(1 min)~1 800 V(4 min)~2 200 V(1 min)。cIEF-WCID可快速、准确测定具有电荷异质性的蛋白类药物等电点,分辨率和重复性好,尤其是可以跟踪聚焦过程中样本的迁移特征,特别适合蛋白类药物复杂电荷异质性的检测。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳测定艾塞那肽等电点

目的:采用新一代全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术(CIEF-WCID)测定艾塞那肽等电点。方法:采用互补性金属氧化物半导体成像技术对样品等电聚焦过程进行实时记录,根据适宜的marker计算得到艾塞那肽的等电点,并对方法的准确度与重复性进行考察。结果:测得艾塞那肽等电点为5.46,与凝胶电泳结果基本一致,相对标准偏差为0.11%。CIEF-WCID方法快速准确,相对误差小于2.5%,重复性良好。结论:CIEF-WCID作为一种新的技术手段可用于艾塞那肽等电点的分析,方法快速、准确、重复性好,可为多肽的质量控制提供一种可靠的分析方法。

基于双特异性抗体的全柱成像毛细管等电聚焦电泳方法开发策略

双特异性抗体是治疗性抗体领域的研究热点,抗体药物的质量控制也一直是生物制药企业和法规机构的关注重点。全柱成像毛细管等电聚焦电泳(Whole-Column Imaging Detection for Capillary Isoelectric Focusing,WCID-CIEF)是检测治疗性双特异性抗体等电点(Isoelectric point,p I)与电荷异质体的有效方法,但由于双特异性抗体分子本身的结构与理化性质复杂,通常需要针对特定分子进行方法开发或优化,以保证分析方法的专属性和良好的分离效果。本文基于双特异性抗体对全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法开发策略进行概述,包括添加剂、载体两性电解质种类与比例、占位剂、上样量、等电点标记物以及工作溶液稳定性等方面,以期为国内双特异性抗体研究与生产提供方法开发上的技术参考。

百日咳黏附素等电点全柱成像毛细管等电聚焦电泳检测方法的建立及验证

目的 建立百日咳黏附素(pertactin,PRN)等电点(isoelectric point,pI)全柱成像毛细管等电聚焦电泳(whole column imaging detection-capillary isoelectric focusing,WCID-CIEF)检测方法,并进行验证。方法 通过优化检测PRN抗原WCID-CIEF过程中的聚焦时间、样品终浓度等参数,建立测定PRN抗原的WCID-CIEF方法,并对方法进行专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性验证。结果 PRN抗原pI WCID-CIEF测定方法的最佳聚焦时间为1 500 V预聚焦1 min,3 000 V聚焦3 min;体系中PRN抗原最佳终浓度为300μg/mL。PRN抗原pI约为6.035,样品缓冲液在抗原各峰位置无干扰峰,方法的专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性均良好。结论 建立的WCID-CIEF方法适用于PRN抗原的pI检测及电荷异质性分析,可为PRN抗原的表征提供依据以及相关疫苗研发和生产过程中的质量控制提供参考。

全柱成像等电聚焦毛细管电泳法对双特异性Fc融合蛋白的电荷异质性分析

建立全柱成像等电聚焦毛细管电泳(WCID-CIEF)分析双特异性Fc融合蛋白电荷异质性方法。方法 通过非还原毛细管电泳法观察酶处理前后峰型的变化,初步确认了该Fc融合蛋白电荷异质性唾液酸相关;结合唾液酸酶酶切和方法优化手段,建立了此融合蛋白的WCID-CIEF分析平台;通过液相质谱法(LC-MS)鉴定了唾液酸相关N-糖构型;通过液相荧光法(LC-FLR)测定了唾液酸的含量。结果 经唾液酸酶酶切和方法优化后,此方法在2.5~7.5 mgmL-1浓度范围内线性良好,R2=0.998,回收率在96.3%~104.6%之间,准确性、专属性和耐用性均满足要求。结论 结合酶处理和方法优化手段,WCID-CIEF可较好地分析融合蛋白的电荷异质性,提供了一种简单、有效的融合蛋白质控手段,并可应用于产品放行及稳定性监测。

重组人脑利钠肽等电点分析全柱成像毛细管等电聚焦电泳法的建立及验证

目的建立重组人脑利钠肽等电点(isoelectric point,pI)分析的全柱成像毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing-whole column imaging detection,CIEF-WCID)法,并进行验证。方法采用CIEF-WCID法对两性电解质、占位剂、蛋白浓度、聚焦时间等进行优化后,获得检测重组人脑利钠肽的最佳检测条件。对建立的方法进行重复性、样品间精密度和耐用性验证,并对连续生产的3批重组人脑利钠肽进行pI分析。结果选择HR AESlyte 8-10.5为两性电解质,25 mmol/L氢氧化钠为占位剂,以87.5μg/mL为样品检测终浓度,聚焦时间为8 min。同一样品连续进样6次,检测pI相对标准偏差(RSD)为0.1%;6份样品检测pI RSD为0.1%;在样品不同终浓度下,主峰pI RSD为0.1%,不同放置时间下,样品pI RSD为0.1%,但pI标记物不可随意更改。连续3批重组人脑利钠肽样品pI均可检出。结论建立的重组人脑利钠肽pI分析的CIEF-WCID法,重复性好、精密度高,可用于重组人脑利钠肽后续的质量控制。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析重组蛋白质药物电荷异质性

目的 分析德谷胰岛素、苏金单抗、阿柏西普和重组人生长激素4种重组蛋白质药物的电荷异质性,为其质量检控提供可靠且快速的分析方法。方法 利用iCE3全柱成像毛细管等电聚焦电泳(imaged capillary isoelectric focusing,iCIEF)分析仪对待测重组蛋白质药物进行检测,将待测样品与载体两性电解质按一定比例混合,在1 500~3 000 V聚焦条件下进行检测。结果 德谷胰岛素等电聚焦电泳图为单峰,等电点平均值为5.25。苏金单抗共检测到4个等电点,其中等电点8.66为主峰,占总峰面积的67.78%。阿柏西普共检测到12个等电点,有6个等电点的峰面积占总峰面积>10%,RSD均<0.10%。重组人生长激素共有3个等电点,其中等电点5.45为主峰占总峰面积的87.60%。结论 利用iCIEF技术能够有效检测德谷胰岛素、苏金单抗、阿柏西普和重组人生长激素的电荷异质性。该方法对4种蛋白质药物的质量检控具有重要意义。

人生长激素Fc融合蛋白电荷异质性全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析方法的建立及验证

目的建立全柱成像毛细管等电聚焦电泳(image capillary isoelectric focusing,iCIEF)方法分析重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)Fc融合蛋白(Fc-rhGH)的电荷异质性,并对方法进行验证。方法通过对目标蛋白浓度、助溶剂(尿素)浓度、聚焦时间的优化建立Fc-rhGH的iCIEF分析方法。采用该方法与传统平板等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)同时分析目标蛋白,并比较分析结果;对建立的方法进行特异性、准确性、精密性、定量限(limit of quantitation,LOQ)、耐用性验证。结果优化后的方法为采用8 mol/L尿素、0.35%甲基纤维素(methyl cellulose,MC)、4%两性电解质、0.5%等电点标记物混合溶液为样品缓冲液,聚焦条件为:1500 V 1 min,3000 V 5.5 min。IEF不适用于分析Fc-rhGH原液的电荷异质性。采用优化的iCIEF进行分析,目标蛋白能明显区别于非相关蛋白,且空白试剂基线平稳;准确性验证回收率在90%~110%之间,线性范围为0.25~0.75 mg/mL(目标上样量的50%~150%);重复性验证中各异构体pI的RSD均小于0.3%,峰面积百分比RSD均小于5%;定量限为0.04 mg/mL;方法的样品保存时间耐用性、两性电解质pharmalyte 3-10耐用性和MC耐用性良好。采用该方法分析Fc-rhGH理化对照品的电荷异质性,可有效分离对照品的8个电荷异质体,pI范围在5.9~6.4。结论建立的iCIEF法具有良好的特异性、准确性、精密性、耐用性,比传统平板IEF更适合高效分析Fc-rhGH的电荷异质性,对Fc-rhGH及其他Fc融合蛋白的质量控制具有重要意义。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳法评价IL-15融和蛋白的电荷异质性

目的:建立全柱成像毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing-whole column imaging detection,c IEF-WCID)方法评价白细胞介素-15(IL-15)融和蛋白的电荷异质性。方法:通过比较5种不同的两性电解质,以及不同尿素浓度(0,3,6和8 mol·L-1)对实验结果的影响,优化建立了IL-15融和蛋白的全柱成像毛细管等电聚焦电泳方法。具体方法为采用3 mol·L-1尿素、0.35%甲基纤维素、4%两性电解质混合溶液作为样品缓冲液,聚焦电压为3 k V,预聚焦时间1 min,聚焦时间7 min。结果:利用新建方法测定了IL-15融和蛋白的等电点范围为6.00～6.71,分离检测到12个异构体,重复性实验中各异构体的峰面积百分比RSD为0.7%～7.4%,等电点RSD为0.0%～0.1%;稳定性实验中各异构体峰面积百分比的RSD为1.5%～10.5%,等电点RSD为0.0%～0.3%;3个不同批次IL-15融和蛋白的各异构体峰面积百分比和等电点基本一致。去N-糖基化及去唾液酸化实验结果表明,IL-15融和蛋白的电荷异构体主要是由N-糖基化不同产生,而酸性端异构体是由于唾液酸化程度不同产生的。结论:研究建立的全柱成像毛细管等电聚焦电泳方法可以有效分离IL-15融和蛋白的12种异构体,糖基化尤其是唾液酸化是引起电荷异质性的主要原因,新建方法对IL-15融和蛋白的质量控制有重要意义。

重组人肠道病毒71型病毒样颗粒等电点全柱成像毛细管等电聚焦电泳测定方法的建立及验证

目的建立重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)等电点(isoelectric point,pI)全柱成像毛细管等电聚焦电泳(whole column imaging detection-capillary isoelectric focusing,WCID-CIEF)测定方法,并进行验证。方法采用WCID-CIEF测定重组人EV71 VLPs的pI,对WCID-CIEF的聚焦时间和尿素浓度进行优化,并对方法的专属性、准确度、重复性和中间精密度进行验证。结果选择3000 V聚焦5 min作为WCIDCIEF的聚焦条件,样品处理时不添加尿素。空白缓冲液对重组人EV71 VLPs pI的测定无干扰;WCID-CIEF分别重复测定pI marker 5.85和pI marker 7.05样品6次的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为0.18%和0.06%;重复测定6次重组人EV71 VLPs pI的RSD为0.08%;不同实验人员在不同日期重复测定12次重组人EV71 VLPs pI的RSD为0.14%。结论WCID-CIEF测定重组人EV71 VLPs pI的专属性、准确度、重复性和中间精密度均良好,该方法快速、准确,可用于重组人EV71 VLPs的质量评价。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳法测定4种生物制品等电点

目的:采用全柱成像毛细管等电聚焦电泳法(WCID-CIEF),测定多肽样品、胰岛素、融合蛋白疫苗和HPV病毒样颗粒的等电点。方法:采用50 mm×100μm石英涂层毛细管。聚焦方法设置:1.5 k V聚焦1 min,3 k V聚焦4 min/8 min;检测波长:280 nm。结果:多肽样品、激素样品胰岛素和融合蛋白疫苗的等电点分别为10.98、5.87和5.86;病毒样颗粒样品HPV 31L1、HPV 33L1、HPV 45L1、HPV 52L1和HPV 58L1的实测等电点分别为8.17、7.86、7.77、7.91和7.69,并且实测等电点与理论等电点基本一致。全柱成像毛细管等电聚焦法测定生物制品专属性和精密度均符合验证要求。结论:该方法可用于生物制品的等电点分析。

毛细管等电聚焦/毛细管无胶筛分电泳二维蛋白质分离平台的构建

设计并制作了一种新型的中空纤维接口 ,以此为核心构建了毛细管等电聚焦 (CIEF) /毛细管无胶筛分 (CNGE)电泳二维蛋白质分离技术平台 ,实现了将二维凝胶电泳从平板转移到毛细管中。利用该二维分离平台 ,对血红蛋白样品进行了高效、快速分离分析 ,验证了该二维分离平台的可行性及分离效能。实验结果表明 :二维分离系统总的峰个数和分离效能都比各自一维分离系统有较大提高。

毛细管等电聚焦-毛细管区带电泳二维蛋白质分离平台的构建及其性能

A two-dimensional separation platform of capillary isoelectric focusing(CIEF)-capillary zone electrophoresis(CZE) for proteins was constructed by a microdialysis hollow fiber interface. The interface provided ease of fabrication,speed of mass delivering and convenience of column switching. Chrome c was selected to demonstrate the 2D separation systems feasibility and resolving performance. The 2D separation system was found to greatly increase the resolving power and overall peak capacity over those obtained for either dimension alone.

毛细管等电聚焦电泳技术进展

介绍了毛细管等电聚焦电泳(CIEF)技术的发展和现状,特别对载体两性电解质、柱内表面处理和检测技术等方面的最新进展加以系统评述,并且对CIEF的定性能力、峰容量、重现性及其在生命科学方面的应用前景进行了讨论。引用文献59篇。

毛细管柱表面鸡卵清蛋白快速改性并用于等电聚焦电泳分离蛋白质

开发了一种利用鸡卵清蛋白改性毛细管柱内表面的快速方法。改性后的毛细管柱可避免蛋白质样品的吸附作用 ,在较温和的条件下 ,柱性能有很好的稳定性 。

毛细管电泳-电喷雾质谱联用技术及其在蛋白质分析领域中的应用

综述了毛细管电泳与电喷雾质谱联用的接口技术、分离模式及其在蛋白质分析领域中的应用 。

毛细管等电聚焦和电渗泵驱动聚焦区带分离蛋白质

建立了一种利用电渗泵驱动毛细管内的聚焦区带,实现毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质的方法。通过控制电压来调节泵的输出流量,从而调节聚焦区带的迁移速度。适用于毛细管电泳等电聚焦两步法分离蛋白质等两性物质。考察了对牛血清白蛋白和溶菌酶两种粗提蛋白质混合物的分离,迁移时间的RSD分别为1.6%和1.3%,峰面积的RSD均为1.6%,证明方法可行。

毛细管电泳技术在单克隆抗体药物分析中的应用

单克隆抗体药物在生物制药行业占有重要地位,是生物医药领域发展的主要方向。因此,单克隆抗体药物的质量控制已成为全球生物制药企业及法规机构关注的热点,对单克隆抗体药物精确表征的需求日益增加。毛细管电泳技术具有分离效率高、分析速度快、分离模式多、样品用量少等特点,已成为单克隆抗体药物分析和质量控制的重要手段。该文对毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管区带电泳等模式在单克隆抗体药物的纯度分析、等电点测定、电荷异质性分析和N-寡糖分析的应用进行综述,以期为国内单克隆抗体研究开发和生产的企事业单位提供技术参考。