SPF鸡胚中内源性白血病病毒全基因序列鉴定与分析

以国内某3家SPF鸡场的SPF鸡胚成纤维细胞提取的基因组DNA为模板,参照已发表的序列,设计合成了4对检测内源性白血病病毒引物,分别检测gag基因、pol基因、env基因和LTR片段,结果显示4者检出阳性率很高(gag,29/46;pol,27/46;env,24/46;LTR,31/46)。设计合成了8对引物,选取4片段检测均为阳性的样品之一,经PCR成功扩增出了8段连续的、相互部分重叠的目的DNA片段,分别连接入T载体进行克隆测序。用DNAstar软件对测序结果进行拼接,从一个鸡胚得到了内源性白血病病毒前病毒全基因组序列。比较分析发现,该序列env基因与已知的E亚群内源性病毒代表株env基因的核苷酸序列同源性在98.5%以上,全基因组序列同源性在99.1%以上,而与其他亚群代表株同源性相对较低,env基因同源性仅为56.3%～91.5%。

2个分离自新疆不同枣树样本的花叶伴随病毒基因组测定

近几年来,新疆南部红枣各种植区大面积发生疑似枣树花叶伴随病毒病症状的病害,造成枣树叶片出现花叶卷曲,枣果畸形失去商品价值,甚至大量落果,造成绝收绝产。对于引起此病害的病原现在尚未完全明确。本文从新疆南部红枣种植区采集病叶,通过高通量测序证实病叶中存在枣树花叶伴随病毒(jujube mosaic-associated virus,JuMaV),将JuMaV的2个分离株AKS和YPH的全序列(登录号分别为MW892537和OL739568),与已发表的枣树枣花叶伴随病毒(JuMaV-Z6)的全序列(登录号:KX852476.1)进行了比较,结果显示,JuMaV-AKS和JuMaV-YPH与JuMaV-Z6的核苷酸一致性分别为99.54%和95.93%,氨基酸一致性分别为100%和98.48%。JuMaV-AKS和JuMaV-YPH与JuMaV-Z6在反转录酶(RT)和RNA酶H(RNase H)编码区有较大差异,表明枣树花叶伴随病毒在新疆的红枣上正在发生变异,但还未成为新的种,暂时统一称为枣树花叶伴随病毒XJ分离株(JuMaVXJ)。上述结果为新疆红枣花叶病病原的确认并为该病害的精准防控奠定了基础。

J亚群禽白血病病毒蛋鸡分离株SD07LK1全基因组核苷酸序列的比较分析

【目的】分析我国ALV-J蛋鸡分离株的来源和进一步演变趋势。【方法】以J亚群禽白血病病毒(ALV-J)蛋鸡分离株SD07LK1感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)基因组DNA作为其前病毒基因组模板,根据已发表序列设计合成9对引物,经PCR扩增出9段连续的、相互部分重叠的DNA片段和闭合环形前病毒两末端LTR的连接区段,并分别连入T载体进行克隆、测序。【结果】用DNAstar软件对测序结果进行剪辑和拼接,首次完成了ALV-J蛋鸡分离株SD07LK1的前病毒全基因组核苷酸序列。【结论】将该序列与另外已完成的全基因组序列的比较表明,ALV-J的整个基因组gag和pol基因相对保守,各毒株间对应基因的同源性分别在95.0%以上,env基因的同源性仅为88.6%～94.0%。

网状内皮组织增生症病毒中国分离株HA9901全基因组核苷酸序列的测定与分析

以网状内皮组织增生症病毒(REV)中国分离株HA9901感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)基因组DNA作为其前病毒基因组模板,根据已发表序列设计合成6对引物,经PCR扩增出6段连续的、相互部分重叠的DNA片段和闭合环形前病毒两末端LTR的连接区段,并分别连入T载体进行克隆、测序.用DNAstar软件对测序结果进行剪辑和拼接,完成了REV第一个中国分离株HA9901前病毒全基因组核苷酸序列.在从截然不同的地区、不同年份、不同禽类分离到的毒株中,将该序列与另两个毒株已完成的全基因组序列的比较表明,REV的整个基因组相对保守,各毒株间对应基因的同源性都在92%以上.其中,从我国鸡体分离到的野毒株HA9901与美国鸡源分离株FA在整个基因组上的同源性均显著高于美国的鸭源SNV株.

中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒gp^(37)基因的序列分析

昆虫杆状病毒的 gp37基因与昆虫痘病毒纺锤体蛋白 (fusolin)基因具有较高的同源性。本研究通过末端测序法和引物步移法双向测定了中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒 (HaSNPV)gp37基因的核苷酸全序列。HaSNPV的 gp37基因开放阅读框为 84 0个核苷酸 ,共编码 2 79个氨基酸 ,预计蛋白质分子量为 31kDa。在 gp37基因起始密码子上游有一典型的杆状病毒晚期转录启动子结构GTAAG和两个TATAboxes。HaSNPVGP37前 18个氨基酸有很强的疏水性 ,可能是分泌信号肽序列。 16种GP37/Fusolin的氨基酸序列同源性比较分析表明 ,HaSNPVGP37与其它gp37基因的同源性较高 ( 4 0 60 % ) ,与痘病毒的Fusolin的同源性达 30 % 4 0 %左右。这些蛋白有 5个高度保守区 ,预计这 5个保守区为GP37/Fusolin的功能区。

日本脑炎ML-17两个变异株的基因组序列及突变分析(英文)

目的鉴别日本脑炎疫苗株ML-17的两个大宽变异株（ML-17L2和ML-17L4）的存在，并通过全基因组序列测定分析引起斑形和毒力改变的基因突变。方法首先对疫苗株ML-17在传代过程中出现的多斑ML-17sh的两个大宽变异株进行纯化和鉴定，再对两个大斑变异株进行全基因组序列测定和全编码氨基酸序列推导。并与小斑疫苗株ML-17及其大斑亲代野毒株JaOH0566的全核苷酸序列和全编码氨基酸序列进行比较，分析引起宽形改变的基因突变。并应用小白鼠试验检查ML-17变异前后的神经侵袭力和毒力变化。结果全基因组序列分析显示两个大斑变异株的核苷酸总数均为10977个，与ML-17和JaOH0566相比较，分剐有33和34个核苷酸变异散在分布于ML-17L2和ML-17L4的全基因组中，其中又分别有12和13个核苷酸导致了氨基酸的改变。在ML-17L2和ML-17L4的衣壳蛋白区没有氨基酸变异，但在包膜蛋白区各有一个氨基酸变异；在5’端非编码区没有核苷酸变异，但在3’端非编码区有3～4个核苷酸变异，且各增加了一个额外的10699核苷酸。ML-17和ML-17sh的小鼠LD50分别为大于1×10^6FFU和481FFU。变异后毒力明显增强。结论发生在两个大斑变异株的第5非结构蛋白区和其它区的氨基酸返祖变异（变回与JaOH0566相同）和新变异，可能引起了宽彤的改变；而全部5个氨基酸返祖变异和2—3个氨基酸新变异可能与其毒力改变有关。本次研究为ML-17L2和ML-17L4的斑形和毒力改变提供了分子遗传学基础。

鹅流感病毒2/96-H_5N_1亚型毒株RNA_(1-3)及RNA_5节段核苷酸全序测定

目的 明确广东鹅流感病毒２９６Ｈ５ Ｎ１ 亚型毒株ＲＮＡ１３ 和ＲＮＡ５ 节段核苷酸全序列及其所编码蛋白的氨基酸序列，以及这些基因节段与香港禽流感病毒１５６９７Ｈ５ Ｎ１ 亚型毒株相应节段间的关系。方法 病毒粒ＲＮＡ经逆转录合成ｃＤＮＡ，经聚合酶链反应（ＰＣＲ） 扩增，产物纯化，采用双脱氧链末端终止法进行核苷酸序列测定。结果 广东鹅流感病毒２９６Ｈ５ Ｎ１ 亚型毒株ＲＮＡ１３ 和ＲＮＡ５ 节段长度分别为２３４１，２ ３４１ ，２ ２３３ 和１５６５ 个核苷酸。它们分别编码ＰＢ２（ 含７５９ 个氨基酸），ＰＢ１（ 含７５７个氨基酸） ，ＰＡ（ 含７１６ 个氨基酸） 和ＮＰ蛋白（ 含４９８ 个核苷酸） 。这些蛋白与香港禽流感病毒１５６９７Ｈ５ Ｎ１ 亚型毒株相应蛋白氨基酸序列的同源性分别为９６－４％ ，９７－２％ ，９７－３ ％ 和９７－０％ 。结论 本毒株ＲＮＡ１３ 和ＲＮＡ５ 节段长度分别为２ ３４１，２ ３４１，２ ２３３ 和１ ５６５ 个核苷酸，它们与香港１５６９７Ｈ５ Ｎ１

二株B亚群禽白血病病毒全基因组序列及其在细胞上的复制性比较

本研究比较了从山东地方品系鸡群分离到的二株B亚型禽白血病病毒(ALV)SDAU09E3和SDAU09C2的全基因组序列及它们在细胞培养上的复制动态。这二株ALV-B的同源性为95.4%,与GenBank中3株B亚群参考株之间的同源性也均在91.0%～94.9%间,而与其它亚群参考株的同源性均低于87.9%。与亚群无关的gag、pol基因和LTR的核苷酸序列比较表明,这二株ALV-Bgp85基因的gag和pol基因与所有比较的参考株的同源性均在93%以上。LTR与其他外源性ALV参考株的LTR间的同源性在72.6%～88.3%范围内,但与E亚群内源性ALV的LTR的同源性只有51.5%。然而,这二个ALV-B的LTR的同源性也只有74.8%,远低于其他基因组部分的同源性,特别是它们的LTR的U3区同源性只有68.8%,二者在二个CAAT分布上也显著不同。对这二株ALV-B在DF-1细胞上的复制动态比较表明,它们在细胞培养上清液中的TCID50值非常类似,但SDAU09E3株核衣壳蛋白p27抗原的含量显著高于SDAU09C2株。这表明,同一亚群的不同毒株在复制过程中,所表达的p27抗原量与所形成的具有传染性的病毒量间没有平行关系。这一差异与LTR-U3区的相关性则有待应用感染性克隆技术来做进一步深入研究。

中国黄热疫苗减毒株和世界卫生组织黄热疫苗标准株基因全序列分析

目的研究中国黄热疫苗生产用减毒株与世界卫生组织(WHO)黄热疫苗标准株的基因序列,了解其核苷酸序列变异程度,和与其相关的氨基酸是否发生突变。方法根据基因库(GenBank)中收录的黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)17D序列设计引物,提取该两株YFV的核酸,逆转录后进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增病毒各部分基因片段,PCR产物纯化后直接测序,5'和3'端TA克隆后进行测序,然后进行遗传进化分析。经核苷酸序列测定进行序列比对分析。结果经序列测定后,进行两株YFV的序列比对,并与GenBank中收录的其它相关YFV17D疫苗株和野毒株进行序列比对,发现中国黄热疫苗生产株与WHO黄热疫苗标准株间的核苷酸序列并未发生较大变异,核苷酸和氨基酸的同源性分别约为99%和99%。其重要病毒抗原E蛋白也未发生较大突变,但发现E区与毒力密切相关的173位氨基酸发生回复突变,进一步通过系统发生分析说明两者亲缘关系十分接近。结论传代过程中,中国黄热疫苗株和WHO黄热疫苗标准株在基因水平上除个别外未发生较大改变,其基因组具有一定的稳定性。