应用穿孔全细胞膜片钳记录技术研究培养大鼠耳蜗螺旋神经节神经元的基本电生理特性

为了深入了解耳蜗螺旋神经节(SG)神经元的基本电生理特点,本研究首先成功培养了急性分离的大鼠SG神经元,然后采用穿孔全细胞膜片钳记录技术观察了培养SG神经元的基本电生理特性。结果表明,可从培养的SG神经元记录到动作电位,且不同的SG神经元具有异质性的放电特征。上述结果提示穿孔全细胞膜片钳记录技术可用于体外培养耳蜗SG神经元的电生理特征研究,为开展听觉信息传导和调控的功能研究开辟了新途径。

快反应电压敏感染料脑片功能性成像结合全细胞膜片钳记录的体外研究

在大脑的许多区域，局部回路的连接被分离成特定的层状体或神经纤维球，如海马、大脑新皮质和嗅球等。在解剖学上这些区域相互分隔。而功能成像对表现回路特征发挥着独特的作用。电压敏感染料成像（voltage-sensitive dye imaging）是通过探测相应脑组织的电活动或局部新陈代谢活动所引起的光学性质的微小变化来进行功能成像的。

人非小细胞肺癌细胞膜钾离子通道特性的研究

目的 研究人非小细胞肺癌细胞膜钾离子通道特性。方法 采用原代培养的非小细胞肺癌细胞、肺部良性病变和癌旁支气管上皮细胞 ,应用膜片钳全细胞记录方式检测细胞膜钾离子通道特性。结果 ( 1)非小细胞肺癌细胞膜K+ 通道表达的K+ 电流具有电压依赖性 ,能被K+ 通道阻断剂TEA阻断。鳞癌细胞膜电流具有失活趋势和内向整流特点 ;腺癌细胞膜电流具有不失活特性 ,无内向整流特点。TP =5 0～ 90mV时 ,时间常数 (τ值 )为 3.6～ 9.8ms。非小细胞肺癌细胞膜电容为 ( 15 .35± 0 .65 )pF ,K+ 电流密度为 ( 12 1.0 8±8.35 )A/F。 ( 2 )非小细胞肺癌细胞膜K+ 电流幅度、电流密度和膜电容较支气管上皮细胞明显增高 (P <0 .0 0 1) ,癌细胞τ值显著小于支气管上皮细胞的τ值 (P <0 .0 0 1)。结论 ( 1)非小细胞肺癌细胞膜存在与延迟整流性类似的钾离子通道 ,且表达明显增加 ,活动明显增强。 ( 2 )检测肺癌细胞膜K+ 通道可为研究肺癌发生、发展。

人肺腺癌细胞膜钾通道特性研究

目的研究人肺腺癌细胞系A-549细胞膜离子通道特性。方法采用膜片钳技术全细胞记录方式检测A-549细胞膜离子通道的特性。结果人肺腺癌细胞系A-549细胞获得稳定的高阻封接的最佳培养时间是细胞传代培养48 h,细胞膜跨膜离子电流具有电压依赖性,在500 ms内不失活,其翻转电位为-70^-80 mV,与细胞膜K+电流的平衡电位相一致。该细胞平均膜电容为(15.13±1.02)pF,TP为+110 mV时细胞膜跨膜通道的电流密度为(48.73±8.58)pA/pF。TP为-40^+110 mV时,细胞膜跨膜通道激活时间常数为12.57~3.14 ms。该跨膜电流能被钾通道阻断剂TEA和CsCl所阻断,表明该跨膜离子电流为K+电流。结论在人肺腺癌细胞系A-549细胞膜上存在一种类似于神经元和肌肉细胞膜上的延迟整流性K+通道。

人肺腺癌A549细胞膜钾离子通道特性与细胞增殖关系的研究

背景与目的肺癌的发生发展、侵袭和转移均受肺癌相关基因的调控,而相关基因的表达、缺失或/和突变常是通过细胞膜信号传导系统和细胞膜离子通道实现的。本研究观察了人肺腺癌细胞系A549细胞膜钾离子通道的特性,以探讨应用钾通道阻断剂抑制肺腺癌细胞增殖的可行性。方法以人肺腺癌细胞系A549细胞为研究对象,采用全细胞膜片钳技术记录细胞膜离子通道特性;通过细胞体外增殖试验,观察钾通道阻断剂四乙胺(TEA)对细胞增殖影响。结果A549细胞在保持电压为-70mV,测试电压-30^+110mV时,记录到一种跨膜电流,该跨膜电流具有电压依赖性、外向整流特性,并且500ms内不失活,可被钾通道阻断剂TEA阻断;细胞体外增殖试验显示,20、40和60mmol/L的TEA作用24h能明显抑制人肺腺癌A549细胞的体外增殖,而0.2和2mmol/L的TEA对细胞的体外增殖无明显抑制作用。结论人肺腺癌细胞系A549细胞中存在外向性电压门控性钾通道,该钾通道可被TEA阻断;钾通道阻断剂TEA能抑制A549细胞的体外增殖,抑制作用与TEA存在剂量依赖关系。

川芎嗪对大鼠背根神经节细胞P2X嘌呤受体介导反应的作用

目的 探讨川芎嗪（tetramethy1pyrazine,TMP）对嘌呤2X（P2X）受体介导反应的作用。方法 在大鼠新鲜分离的背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）神经元标本上应用全细胞膜片钳技术记录川芎嗪对P2X受体激动剂激活电流的影响。结果 外加ATP（1～1 000 μmol·L^-1）可引起DRG神经元产生激活电流（n=102）,ATP-激活电流（IATP）显示快失敏和慢失敏两种形式的内向电流。预加川芎嗪（0.1～10 mmol· L^-1）后，大部分（89.2%,91/102）受检细胞可观察到ATP（100 μmol·L^-1）-激活电流出现明显的抑制作用。川芎嗪 （1 mmol· L^-1）使α,β-meATP （10 μmol·L^-1）-激活电流减小。预加川芎嗪（1 mmol·L^-1）后ATP（1～1 000 μmol·L^-1）激活电流的剂量-效应曲线明显下移。预加川芎嗪（1 mmol·L^-1）前后ATP（100 μmol·L^-1）的I-V曲线反转电位值不变，均接近0 mV.川芎嗪（1 mmol·L^-1）可明显抑制被前列腺素E2（100 μmol·L^-1）或P物质（0.1 μmol·L^-1）增大的ATP激活电流。通过微电极胞内透析注入PKA抑制剂H89（10 μmol·L^-1）至胞内,使川芎嗪（1 mmol· L^-1）抑制ATP（100 μmol·L^-1）激活电流的作用减小。结论 川芎嗪可能是通过PKA系统以及P2X受体离子通道复合体细胞外环的变构调制点影响P2X受体激动剂在大鼠DRG神经元的激活电流.

硝普钠对豚鼠耳蜗外毛细胞能动性影响的初步研究

目的 研究硝普钠 (sodiumnitroprusside,SNP)对耳蜗OHC在电压刺激下的能动性的改变情况。方法 运用全细胞膜片钳电压钳技术 ,在正常细胞内外液的条件下 ,观察不同浓度SNP对电压性刺激引起OHC能动性的影响情况。结果 在SNP浓度低于 10 0 μMol L时 ,SNP对OHC能动性的影响不明显 ,但当SNP浓度高于 10 0μMol L时 ,SNP对OHC的能动性有明显的抑制作用 ,结果有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论 SNP对OHC的能动性有抑制作用 。

缬沙坦对豚鼠心室肌细胞动作电位的作用

目的:观察缬沙坦对豚鼠心室肌细胞动作电位的直接作用,以探讨其可能的抗心律失常作用。方法:采用Langendorff主动脉逆行灌流酶解分离法分离单个心室肌细胞。采用全细胞膜片钳记录,电流钳模式记录单个心室肌细胞的动作电位。实验分3组:对照组(n=5),普通细胞外液灌流,不含缬沙坦;缬沙坦5μM组(n=5);缬沙坦100μM组(n=5)。结果:缬沙坦5μM对豚鼠心室肌细胞静息膜电位、动作电位幅度、动作电位时程均无明显影响。缬沙坦100μM可延长心室肌细胞动作屯位时程,尤其是APD50从(334.2±14.4)ms延长至(375.2士12.0)ms(P<0.01)及APD30从(395.4士13.3)ms延长至(451.4±9.5)ms(P<0.01),对细胞静息膜电位、动作电位幅度无显著影响。结论:高浓度缬沙坦延长心室肌细胞动作电位时程APD50及APD90,而不影响动作电位的静息膜电位及动作电位幅度。适度延长动作电位时程,从而延长心室有效不应期,有助于折返引起的快速室性心律失常的防治,类似Ⅲ类抗心律失常药物的作用。提示缬沙坦可能通过此机制起抗心律失常的作用。

小鼠心室肌细胞分离方法的改进

目的：探索更简单实用和重复性好的小鼠心肌细胞分离技术．方法：实验于2005～05／09在大连大学医学院医学研究中心完成．选择8～16周龄昆明小鼠150只，雌雄不拘，体质量30～40g，由大连大学医学院动物中心提供．采用原位主动脉插管和动脉夹固定法酶解分离小鼠心室肌细胞，并在室温下进行全细胞膜片钳记录．结果：可将主动脉插管的时间控制在1．5min内，所获心室肌细胞横纹清晰，一次性复钙可获得50％～60％的耐钙细胞，分离所得细胞可在全细胞膜片钳方式下记录到一过性外向钾电流（Ito）.

琥珀酸在海马CA1区对突触前GABA释放的影响

为了观察琥珀酸在大鼠海马CA1区对突触前GABA释放的影响,我们采用红外可视全细胞膜片钳技术记录了琥珀酸对γ-氨基丁酸(GABA)能自发性微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic currents,mIPSCs)的作用。结果显示不同浓度的琥珀酸(10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L和10-3mol/L)在海马CA1区均能以浓度依赖的方式增强GABA能mIPSCs的频率,而对其电流幅度没有影响。10-4mol/L琥珀酸组GABA能mIPSCs的频率为2.25±0.99Hz,与正常对照组相比有显著性差异(n=8,P<0.01),而其电流幅度为31.63±6.16pA,与正常对照组相比没有差异(n=8,P>0.05)。以上实验结果表明琥珀酸能通过增强突触前GABA的自发性释放,对海马CA1区神经元产生超极化作用,此作用可能是琥珀酸抑制癫痫形成的主要方式之一。

大鼠三叉神经节神经元5-羟色胺激活电流及其特征

采用全细胞膜片钳技术观察大鼠三叉神经节神经元5-羟色胺激活电流(I5-HT)及其特征。在大多数受检细胞(64／87,73.6％)特别是中、小型细胞,外加5-HT可引起一快去敏感的内向电流,此内向电流可被5-HT3受体特异性激动剂2-甲基-5-羟色胺所模拟,被5-HT3受体拮抗剂ICS 250-930可逆性阻断。I5-HT浓度-反应曲线的阈浓度为3×10-7mol／L,饱和浓度约为3×10-3mol／L,EC50为21.4+2.2μmol／L,Hill系数为0.96。I5-HT的翻转电位在-2.5 mV左右。胞内透析GDP-β-S证明I5-HT不依赖于G蛋白而存在。本研究结果为了解5-HT3受体介导电流及其特征提供了有关的资料。

神经肽Y对海马神经元“癫痫样”动作电位的影响

目的探讨神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)对海马神经元"癫痫样"动作电位的影响。方法用无镁细胞外液处理原代培养12 d的海马神经元3 h,诱导海马神经元癫痫样放电,建立海马神经元癫痫样放电模型;用全细胞膜片钳电流钳模式检测神经元动作电位,分别给予0.1μmol/L和1μmol/L NPY各1μL,给药时间10 s,观察其对神经元动作电位频率及波幅的影响。结果无镁细胞外液处理神经元3 h,可以形成稳定的海马神经元癫痫样放电模型,频率16～23 Hz,波幅75～96 mV。模型组神经元动作电位频率为(18.00±2.32)Hz,而0.1μmol/L和1μmol/L NPY组分别为(4.75±1.04)Hz和(1.50±0.75)Hz。与模型组相比较,两种浓度NPY组均降低了动作电位发放的频率(P<0.05)。模型组神经元动作电位波幅为(82.25±5.17)mV,而0.1μmol/L和1μmol/L NPY组分别为(49.75±2.49)mV和(40.00±2.20)mV。与模型组相比较,两种浓度NPY组均降低了动作电位发放的波幅(P<0.05)。两种浓度NPY之间相比较,也有统计学差异(P<0.05)。1μmol/LNPY明显抑制了动作电位发放的频率和波幅。结论 NPY能够抑制无镁细胞外液诱发的神经元癫痫样电活动,为应用NPY抑制癫痫发作提供了细胞电生理学证据。

IGF-1对海马神经元抑制性突触传递的影响

目的：观察胰岛素样生长因子1（IGF-1）对原代培养海马神经元抑制性突触传递的影响并探讨其可能机制。方法：采用无血清培养基培养海马神经元,在10～14d时用于实验。电生理实验分为正常对照组和IGF-1处理组（实验前24h加入IGF-1,终浓度为10μmol/L）。细胞免疫化学实验分为正常对照组、IGF-1处理组和MAPKS转导通路抑制剂（PD98059）预处理组（IGF-1处理前1h加入PD98059,终浓度为10μmol/L）。采用全细胞膜片钳记录方法观察IGF-1对抑制性突触后电流（IPSC）的影响,用细胞免疫化学方法观察其对γ-氨基丁酸能细胞数目影响。结果：IGF-1能够显著降低IPSC的频率,但与对照组比较其幅度差异无统计学意义;IGF-1能够明显减少GABA阳性细胞数目,应用PD98059后可阻断这种作用。结论：IGF-1的上述作用可能参与海马对学习记忆功能的调节过程。

咖啡因对大鼠背根神经节急性分离神经元GABA-激活电流的抑制作用

应用全细胞膜片钳记录技术,在大鼠新鲜分离背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元上,观察预加咖啡因对GABA-激活电流(I_(GABA))的调制作用。实验中,大部分受检细胞(97.4%,113/116)对外加GABA敏感。1～1000μmol/L GABA引起一剂量依赖性、有明显去敏感作用的内向电流。在受检的108个DRG细胞中,约有半数(53.7%,58/108)对胞外加咖啡因(0.1～100μmol/L)敏感,产生一幅值很小的内向电流。预加咖啡因(0.1～100μmol/L)30s后再加GABA能明显抑制GABA(100μmol/L)激活电流的幅值。预加咖啡因后GABA量效曲线明显下移;GABA-激活电流的最大值较之对照下降约57%;而K_d值(30μmol/L)几乎不变,表示此种抑制为非竞争性的。预加安定(diazepam,1μmol/L)对GABA(100μmol/L)激活电流有增强作用,而预加咖啡因(10μmol/L)有拮抗安定增强I_(GABA)的作用。胞内透析H-8后,几乎可以完全消除咖啡因对I_(GABA)的抑制作用。已知GABA作用于初级感觉神经元能引起初级传入去极化,因而实验结果提示,咖啡因有可能在初级传入末梢产生对抗突触前抑制的效应。

神经肽Y对海马神经元兴奋性突触活动的影响

目的观察神经肽Y(NPY)对体外培养海马神经元兴奋性突触活动的影响。方法 Wistar大鼠海马神经元体外原代培养,无镁细胞外液处理3h,建立稳定的海马神经元癫痫样放电模型,应用全细胞膜片钳记录技术,观察不同浓度NPY对海马神经元自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)的影响。结果 (1)体外培养12d的海马神经元轮廓清晰,折光性良好,彼此间广泛突触联系形成,适于神经元电生理试验。(2)癫痫组神经元sEPSCs发放频率(28.826±1.254HZ)高于对照组(1.296±0.241HZ),差异有统计学意义(P<0.05)。0.1μmol NPY组sEPSCs的频率为0.895±0.146HZ;1μmol NPY组频率为0.461±0.394HZ,与癫痫组(28.826±1.254HZ)相比,均有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。0.1μmol NPY组的频率降低的程度小于1μmol NPY组神经元,差异有统计学意义(P<0.05)。sEPSCs幅度各组相比无明显差异(P>0.05)。结论 NPY能够抑制癫痫神经元sEPSCs的频率,而不影响幅度,这为NPY基因治疗癫痫提供了电生理学证据。

咖啡因对急性分离大鼠DRG神经元GABA-激活电流的调制作用(英文)

应用全细胞膜片钳记录大鼠新鲜分离背根神经节(DRG)神经元GABA-激活电流,观察咖啡因对GABA-激活电流(IGABA)的调制作用。结果显示:大部分受检细胞(97.4%,113/116)对外加GABA敏感。1-1000μmol/LGABA引起一剂量依赖性、有明显去敏感作用的内向电流。预加咖啡因(0.01-100μmol/L)30s后再加GABA能明显抑制GABA(100μmol/L)激活电流的幅值。预加咖啡因后GABA量效曲线明显下移;GABA-激活电流的最大值较之对照下降约57%;而Kd值(30μmol/L)几乎不变。该结果提示此种抑制为非竞争性的。预加氨茶碱(theophylline)亦可明显抑制GABA激活电流,同一浓度(10μmol/L)下氨茶碱的抑制作用较咖啡因的抑制作用强。预加安定(diazepam,1μmol/L)对GABA(10μmol/L)激活电流有增强作用,而预加咖啡因(10μmol/L)有拮抗安定增强IGABA的作用。胞内透析H-8后,几乎可以完全消除咖啡因对IGABA的抑制作用。本结果表明咖啡因在初级传入末稍可能产生对抗突触前抑制的效应。

Tacrine对大鼠三叉神经节神经元5-HT激活电流的调制作用

目的 研究他可林（tacrine）对急性分离的大鼠三叉神经节神经元5-HT。受体的调制作用，探讨tacrine治疗阿尔茨海默病新的可能途径。方法 采用全细胞膜片钳技术记录急性分离的三叉神经节神经元膜5-HT。受体介导的电流。结果 83．75％（67／80）受检细胞对胞外加5-HT（10^-6～10^-3mol／1，）敏感，引起一快去敏感的内向电流，同时应用tacrine（10^-6～10^-4mol／L），5-HT激活电流被不同程度抑制，抑制作用随tacrine浓度的增加而增强，抑制作用的IC50值为3×10^-5mol／L。结论 Tacrine可抑制5-HT诱导的三叉神经节神经元膜电流，这可能是其改善阿尔茨海默病患者学习记忆功能障碍的机制之一。

5-HT_2受体介导大鼠DRG神经元膜GABA 激活电流的增强作用(英文)

目的 探讨 5 HT对大鼠DRG神经元膜GABA 激活电流的调节作用及其机制。方法 在新鲜分离的大鼠DRG神经元标本上,以全细胞膜片钳技术记录膜电流,用排管快速换液装置行胞外给药,以胞内透析技术分析信号转导途径。结果 给予GABA可使多数受检细胞产生浓度依赖性内向电流 (IGABA)。预加 5 HT,可使IGABA增加。此效应可被 5 HT2受体特异性激动剂α methyl 5 HT( 1×10-6mol·L-1 )所模拟,被 5 HT2受体选择性拮抗剂cyproheptadine所阻断。在部分细胞, 5 HT本身可引起由 5 HT3受体介导的快速内向电流,但并未发现该电流与 5 HT对IGABA的增强作用有必然的联系。从GABA激活电流的量效曲线可见,预加 5 HT后和对照曲线相比,阈浓度不变、EC50值相近,IGABA最大值增加 33. 6%。胞内透析GDP β S或H 7可取消 5 HT增强IGABA的效应,而透析H 9无效。结论 5 HT可增强GABA 激活电流,其机制为 5 HT2受体激活后通过PKC引起GABAA受体胞内磷酸化所致。

大鼠脊髓背角胶状质神经元的去极化反跳及调控机制

目的研究大鼠脊髓背角胶状质(SG)神经元的去极化反跳及调控机制,以期对去极化反跳相关疾病的临床治疗提供参考。方法选取3~5周龄SD大鼠,制作离体脊髓纵切片,应用全细胞膜片钳技术记录SG神经元的电生理学特点及接受超极化刺激后的反应,并观察超极化激活环核苷酸门控阳离子(HCN)通道阻断剂和T型钙(Cav3)通道阻断剂对去极化反跳的作用。结果共记录了63个SG神经元的电活动,其中23个无去极化反跳,19个为去极化反跳无放电,21个为去极化反跳伴放电。无去极化反跳组SG神经元的动作电位阈值(-28.7±1.6 m V)明显高于去极化反跳伴放电组(-36.0±2.0 m V)(P<0.05)。HCN通道阻断剂氯化铯和ZD7288可显著延长去极化反跳伴放电的潜伏期,分别从45.9±11.6 ms增加到121.6±51.3 ms(P<0.05)和从36.2±10.3 ms增加到73.6±13.6 ms(P<0.05);ZD7288也能显著延长去极化反跳不伴放电的潜伏期,从71.9±35.1 ms增加到267.0±68.8 ms(P<0.05),而T型钙通道阻断剂氯化镍和米贝地尔可显著降低去极化反跳伴放电的振幅,分别从19.9±6.3 m V降到9.5±4.5 m V(P<0.05)和从26.1±9.4 m V降到15.5±5.0 m V(P<0.05),米贝地尔同样能显著降低去极化反跳不伴放电的振幅,从14.3±3.0 m V降低至7.9±2.0 m V(P<0.05)。结论近2/3的SG神经元有去极化反跳,其潜伏期和振幅分别受HCN通道和T型钙通道调控。

大鼠脊髓背角胶状质神经元去极化反跳参与大鼠慢性神经病理性疼痛

目的:探索脊髓背角胶状质(substantia gelatinosa,SG)神经元去极化反跳的电生理特性,进一步阐明疼痛的脊髓调控机理,为慢性疼痛疾病的治疗药物研发提供科学依据。方法:取4周龄雄性SD大鼠66只,随机分为3组(n=22):模型组(坐骨神经部分结扎,PSNL)、假手术组(sham)和对照组(control)。测量三组大鼠机械痛阈,膜片钳记录去极化反跳等电生理特性,进行对比分析。结果:(1)模型组术后7~14d机械痛阈明显低于另外两组(P<0.05);(2)每组SG神经元均有50%以上出现去极化反跳现象,而且模型组去极化反跳出现的概率明显高于另外两组(P<0.05);(3)模型组SG神经元的动作电位阈值明显低于其他两组,输入阻抗和动作电位频率均高于另外两组(P<0.05)。结论:大鼠坐骨神经部分结扎术后去极化反跳现象增加,神经元兴奋性增高,出现机械痛敏,提示SG神经元去极化反跳可能参与慢性疼痛的调控。