全自动核酸提取仪对不同类型ASFV、PEDV样品的提取效果

研究以非洲猪瘟病毒(ASFV)的各类型阳性样品以及流行性腹泻病毒(PEDV)阳性样品为检测对象,评测全自动核酸提取仪对DNA和RNA核酸的提取效果,旨在帮助动物疫病检测实验室了解如何评测全自动核酸提取仪是否满足检测需求。试验选用已经过检测结果为阳性的不同类型ASFV样本和PEDV阳性的粪便拭子样品,进行10倍梯度稀释并将检测结果与已知的检测原值进行对比。结果显示,试验使用的核酸提取仪的稳定性满足需求,但敏感性较差,可能存在环境、人员、车辆等病毒含量低的样品被漏检。在抗干扰方面,试验使用的核酸提取仪对咽喉拭子的核酸提取结果存在假阴性的情况;该仪器对肛门拭子和环境样品的抗干扰性不佳,也可能出现假阴性结果;该仪器不会受样品影响而检测出假阳性结果。

基于全自动核酸提取的荧光定量PCR鉴别羊肉制品真伪

目的建立一种基于自动化的快速核酸提取方法,联合三重实时荧光定量PCR技术,鉴别羊肉制品的真伪。方法分别采用全自动核酸提取法、磁珠手提法与柱提法对不同状态羊肉制品进行核酸提取,比较不同方法的提取时间差异,通过三重实时荧光定量PCR扩增结果评估不同方法的提取效果。以GB/T38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》为对照,对市售的羊肉制品进行平行检测,评估本方法的检测性能。结果与磁珠手提法、柱提法相比,全自动核酸提取法的提取时间缩短了15~30 min,且提取的核酸扩增效果更好。全自动核酸提取法在羊猪混合样品中羊源核酸检出限为0.010mg/g。全自动核酸提取法在生鲜肉、生肉及熟肉制品等多种类型产品中提取的羊源核酸PCR检测结果的变异系数(coefficient of variation,CV)均小于3.000%。分别采用三重实时荧光定量PCR法与GB/T38164—2019对全自动提取的21份市售的涵盖不同类型的羊肉制品核酸进行平行检测,符合率为100.00%。结论本研究方法可为羊肉制品掺假的快速真伪鉴别提供操作简便、稳定灵敏、快速准确的整套解决方案。

全自动核酸提取仪对三种性传播病原体检测的性能评价

目的评价全自动核酸(RNA)提取仪(型号MagX)对沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)和解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum,UU)检测结果应用于临床的可行性。方法收集检测CT样本159例、NG样本128例、UU样本144例,应用荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing,SAT),同一样本分别采用手工提取分装加样和MagX提取分装加样两种检测方法,然后进行实时荧光PCR。以手工检测结果为金标准,对MagX检测结果进行阳性符合率(灵敏度)、阴性符合率(特异度)、总符合率(准确度)的评价。同时,对该仪器进行防污染验证。全自动核酸(RNA)提取仪与手工检测结果进行Kappa一致性分析。结果 159例CT,128例NG和144例UU样本的阳性符合率、阴性符合率、总符合率依次为CT:0.910 6,92.59%,98.48%和97.48%;NG:0.938 3,100.00%,98.18%和98.44%;UU:0.885 6,93.33%,95.24%和94.44%;其Kappa系数均>0.8(CT:Kappa=0.910 6,NG:Kappa=0.938 3,UU:Kappa=0.885 6),CV值均<5%;没有携带污染现象存在。结论上海仁度生物科技生产的CT,NG和UU核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)在全自动核酸(RNA)提取仪(型号MagX)的检测符合临床检测标准,可在临床使用。

全自动核酸提取仪与手动提取组织DNA的效率比较

近年，随着众多与疾病诊断、预后及治疗相关的分子标志物的出现，以石蜡组织DNA为材料进行分子水平的基因检测及筛查已成为临床诊断及相关研究的常规手段。对于各种基因分析而言，重要的是能够获得足够纯度和数量的DNA。DNA提取是分子生物学研究的一项基础技术，其提取的质量好坏及数量的多少直接影响到分子生物学实验的开展。

全自动核酸提取仪联合真空浓缩仪在法医学中的应用

目的探讨全自动核酸提取仪联合真空浓缩仪在法医学DNA提取中的应用价值。方法采集人外周静脉血稀释成40、80、120、160、200、240、280和320倍的梯度样本,并对每一梯度的样本分别进行无抑制剂、加黑机油、加铁锈、加果酸、加锡纸、加靛蓝6种处理。应用全自动核酸提取仪对上述样本进行DNA纯化提取,提取后的DNA洗脱液取6μL直接进行扩增,剩余部分使用真空浓缩仪进行浓缩,浓缩前后的DNA均使用Investigator 26plex QS试剂盒进行扩增、检测。结果添加果酸的梯度样本仅在40倍稀释时获得完整STR分型结果,另外5种方式处理的梯度样本在40~160倍稀释时均获得完整的STR分型。DNA浓缩后的STR分型结果显示,平均峰高和基因座检出率均有一定程度的提高,但是效果并不明显。结论全自动核酸提取仪具有高效的抑制剂去除能力和DNA提取效率,真空浓缩仪可在一定程度上浓缩DNA,两者联合使用可提高法医学检材的检验成功率。

4种全自动核酸提取仪提取全血DNA效率的比较

目的比较4种全自动核酸提取仪在全血基因组检测中的核酸提取效果。方法分别用4个厂家的全自动核酸提取仪按预定的提取程序自动执行全血核酸提取,并与本实验室手工提取的核酸进行纯度和浓度比较。结果 4种全自动核酸提取仪提取全血核酸的260/280值均满足纯度1.7~2.0要求,并且核酸提取浓度高于本实验手工提取法或与本实验室手工提取法相当。结论 这4种全自动核酸提取仪提取效果优,自动化程度高,能满足临床标本应用。

不同核酸提取方法对HBV-DNA检测性能验证情况分析

目的评估2种乙型肝炎病毒(HBV)-DNA提取方法及2家检测试剂的性能,有助于选择优化提取试剂和检测试剂。方法2023年4月采用达安全自动核酸提取仪提取法(磁珠法)和手工提取法(一步法),并用达安和圣湘2种HBV-DNA试剂检测,对其进行精密度、正确度、线性范围、检出限及抗干扰能力等性能进行验证和评价。结果达安全自动核酸提取仪提取达安试剂检测、手工提取达安试剂检测和手工提取圣湘试剂检测在精密度、正确度、线性范围、检出限方面验证结果均达标;达安全自动核酸提取仪提取圣湘试剂检测在低值检测中变异系数大于5%,最低检测限验证不合格;抗干扰能力方面,全自动核酸提取仪提取的2.0 g/dL血红蛋白浓度的样本用达安和圣湘试剂检测结果均不受影响。手工提取甘油三酯浓度达3000 mg/dL的样本用达安和圣湘试剂检测的结果均不受影响。结论不同厂家的提取和检测试剂避免混用,达安和圣湘试剂对HBV-DNA定量检测的结果均符合要求。

三种全自动核酸提取仪提取2019-nCoV RNA性能比较研究

目的比较3种全自动核酸提取仪的检测结果,探讨国产全自动核酸提取仪对2019-nCoV RNA的检测性能。方法分别用甲(进口)、乙(国产)、丙(国产)3台全自动核酸提取仪,选用康彻思坦生物2019-nCoV RNA(液体)质控品S5(批号202007002,参考水平1000 cp/mL)作为实验对象,对该质控品进行10~1000倍系列稀释,配制成不同浓度的质控品作为实验样本。其中甲提取仪使用甲配套试剂,乙、丙属于同一厂家不同型号,均使用其配套试剂和第三方试剂,用以评价防污染能力、精密度、准确性、重复性、检测下限及线性相关性。结果以进口品牌甲作为参考标准进行比较;使用乙配套试剂时,乙、丙与甲的线性相关系数分别为:0.980、0.995(N端);0.991、0.983(ORF1ab端);使用第三方试剂时,乙、丙与甲的线性相关系数分别为:0.999、0.915(N端);0.997、0.825(ORF1ab端)。结论国产品牌乙、丙提取仪提取2019-nCoV RNA可以实现全自动操作,相关性较好,系统性能可与国际水平相当,且提取时间较甲短,在标本数量较多时,有明显优势。

手动提取与自动化核酸提取对核酸质量影响分析

目的:探讨手动提取与全自动核酸纯化仪对分子病理检测中的福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)提取DNA的核酸质量影响分析。方法:选取2022年3—12月电子科技大学医学院附属绵阳医院<绵阳市中心医院>病理科存档的20份经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的组织标本,包括手术大标本10份,穿刺小标本10份。手术大组织标本每例连续切片9张,编号1~9,其中编号为单号的切片用人工手动提取(n=5),双号的切片用全自动核酸提取仪提取(n=4),编号9玻片进行HE染色质控。穿刺小组织标本每例连续切片21张,编号1~21,其中编号为单号的切片用人工手动提取(n=11),双号的切片用全自动核酸提取仪提取(n=10),编号21玻片进行HE染色质控。比较手动提取和全自动核酸纯化仪提取石蜡组织DNA的浓度、纯度及PCR可行性。结果:全自动核酸提取仪石蜡组织DNA提取浓度更高(P<0.05),纯度差异不显著,均能满足分子检测需求。结论:全自动核酸纯化仪自动化程高,污染概率低,提取效率高,值得推广。

血液混样HCV/HIV-1 RNA全自动提取方法的应用评价

目的:建立献血者全自动核酸检测方法,探讨在我国血液筛查中引进全自动核酸筛查的可行性。方法:选用STAR2000加样仪进行血样汇集(24人份),在COBASAMPLICOR进行扩增和检测分析结果,从灵敏度及抗干扰能力方面进行评价。结果:用国际标准核酸质控品考评及常规应用,表明全自动汇集、全自动核酸提取及扩增和检测95%的检出限量HCVRNA和HIV-1RNA分别为17·4IU/ml和20·6cp/ml,20mg/ml胆红素、1g/dl血色素及中等程度的脂血对结果无影响。通过对16512个样本共688汇集池分析,HCVRNA阳性1例(ELISA亦阳性),HIV-1RNA未检出阳性。结论:血液混样MPLC全自动核酸提取方法可应用于血液HCVRNA和HIV-1RNA的筛查工作。

甲型H1N1流感病毒采用不同核酸提取方法的比较研究

目的研究甲型H1N1流感病毒核酸提取的比较准确和有效的方法。方法选用2014年12月至2015年12月就诊的甲型H1N1流感患者的咽拭子共40份作为研究对象。对所获得的标本进行10-1~10-4的系列稀释,获得不同浓度的流感病毒标本备检。主要采用三种试剂盒进行实验:一种是Promega公司的Maxwell16全自动核酸提取仪以及该提取仪的配套试剂盒,为A组,一种是QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit,为B组,第三种则是国产的H生物公司的RNA提取试剂盒,为C组。对三种方法的核酸提取情况进行比较。结果对同一份咽拭子的核酸进行提取,A组所提取的总RNA浓度最高,B组的总RNA浓度次之,C组的总RNA浓度最低。A组在各个稀释浓度的流感病毒提取率均较高,差异均具有统计学意义(P<0.05);C组和B组随着稀释浓度的增大,流感病毒的提取率逐渐降低,尤其是C组当稀释浓度为10-4时,提取不到流感病毒。结论全自动核酸提取仪对核酸的提取效果较好,即使在高倍稀释的情况下也能够达到较高的核酸提取率,避免了手工提取的误差,是一种快捷有效的检测方法,值得在临床上推广使用。

乙肝病毒DNA检测2种不同核酸提取方法的性能验证情况分析

目的:对乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测的2种不同核酸提取方法,即手工法(煮沸法)和全自动核酸提取仪法(磁珠法),在使用相同的检测试剂和核酸扩增仪的条件下进行性能验证,以评价其验证结果。方法:依据《医学实验室质量和能力认可准则》《全国临床检验操作规程》等相关文件,由同一操作人员应用中山达安公司生产的HBV-DNA检测试剂盒和ABI7500实时荧光核酸扩增仪,分别采用手工法和全自动核酸提取仪法提取HBV-DNA进行临床样本的批内精密度、批间精密度、正确度、线性范围性能验证实验。结果:手工法的高值血清批内精密度为2.18%,低值血清批内精密度为3.76%;高值质控品批间精密度为3.29%。全自动核酸提取仪法的高值血清批内精密度为1.78%,低值血清批内精密度为2.44%;高值质控品批间精密度为2.84%。正确度验证分别取浓度为2.0×10^3、2.0×10^4、2.0×10^5、2.0×10^6copies/ml的可溯源标准品进行验证,手工法偏倚分别为-4.88%、-2.51%、-2.46%,-2.12%,全自动核酸提取仪法偏倚分别为-2.37%、-0.95%、0.74%、-1.33%。线性范围验证中,手工法和全自动核酸提取仪法的相关系数分别为0.9660、0.9858,均能满足临床检测的需求。结论:全自动核酸提取仪法较手工法提取核酸有利于简化HBV-DNA提取流程,实现分子生物实验室自动化提取核酸。

HBV-DNA全自动检测系统的性能验证

目的对国产HBV-DNA全自动核酸提取仪及实时荧光定量PCR试剂(磁珠法)检测性能参数进行验证,评价其是否可应用于临床检测。方法依据CNAS《医学实验室质量和能力认可准则》相关文件对检测系统的精密度、线性范围、检测线、正确度、抗干扰能力、特异性进行性能验证。结果批间及中间精密度CV均<5%,标准差(s)分别<0.24、0.32。线性范围为1.03×102~2.71×107,检测线为100 IU/mL,正确度符合要求(<靶值对数值±0.4)。血红蛋白(≤2 g/dL)、胆红素(≤28 mg/dL)、甘油三脂(≤3000 mg/dL)对检测结果无影响,特异性符合要求。结论本实验室HBV-DNA全自动检测系统符合YY/T 1182—2010《核酸扩增检测用试剂(盒)》要求,可应用于临床检测工作。

3种核酸提取方法检测甲型H1N1流感病毒的比较

目的选择常见的3种核酸提取方法,比较其对低拷贝数甲型H1N1流感病毒核酸检测的敏感性差异,为实验室应用和结果的评价提供依据。方法对已确定阳性的甲型H1N1流感病毒标本,作10-1～10-4系列稀释,选用Promega公司全自动核酸提取仪及配套试剂盒、QIAGEN公司Rneasy MiniKit和国产H公司提取试剂盒3种核酸提取方法提取上述标本核酸模板,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(荧光RT-PCR)对其进行评价。结果在对不同拷贝数流感病毒的检测中,3种核酸提取方法以Promega公司全自动核酸提取仪提取效率最高,以此提取效率作为100%,则QIAGEN Rneasy MiniKit和国产H公司提取试剂盒的平均提取效率依次为83.27%、55.70%。经方差分析,3种方法之间存在显著性差异(P<0.05)。结论各试剂之间提取核酸的效率存在显著差异,建议根据实际情况采用合适的核酸提取试剂和方法。