磁珠法核酸提取设备的专利申请现状

为了获取基于磁珠法核酸提取装置相关的国内外申请状况的基本数据,本文在incoPat数据库中选择“磁珠or磁5W粒”和“核酸提取”和“装置or设备or仪or系统”等关键词进行检索,总共获得1 410件专利申请,其中国内申请1 258件,国外152件。通过对数据不同维度的分析,探讨了该领域相关专利申请的趋势、全球申请人情况、主要分类号等方面。

不同核酸提取方法对HBV-DNA检测性能验证情况分析

目的评估2种乙型肝炎病毒(HBV)-DNA提取方法及2家检测试剂的性能,有助于选择优化提取试剂和检测试剂。方法2023年4月采用达安全自动核酸提取仪提取法(磁珠法)和手工提取法(一步法),并用达安和圣湘2种HBV-DNA试剂检测,对其进行精密度、正确度、线性范围、检出限及抗干扰能力等性能进行验证和评价。结果达安全自动核酸提取仪提取达安试剂检测、手工提取达安试剂检测和手工提取圣湘试剂检测在精密度、正确度、线性范围、检出限方面验证结果均达标;达安全自动核酸提取仪提取圣湘试剂检测在低值检测中变异系数大于5%,最低检测限验证不合格;抗干扰能力方面,全自动核酸提取仪提取的2.0 g/dL血红蛋白浓度的样本用达安和圣湘试剂检测结果均不受影响。手工提取甘油三酯浓度达3000 mg/dL的样本用达安和圣湘试剂检测的结果均不受影响。结论不同厂家的提取和检测试剂避免混用,达安和圣湘试剂对HBV-DNA定量检测的结果均符合要求。

磁珠法提取新型冠状病毒核酸的稳定性

目的探索磁珠法提取新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸及其与试剂混合后的稳定性。方法将国家卫生健康委员会临床检验中心(NCCL)和四川省临床检验中心(SPCCL)提供的32份SARS-CoV-2室间质量评价(EQA)样本分为4组,每组含3份NCCL样本和5份SPCCL样本。所有样本均采用磁珠法提取核酸,得到的核酸采用实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法立即检测1次(靶基因为ORF1ab基因和N基因),即为各样本的初始结果。各样本余下的核酸按以下方式处理:第1组和第2组样本的核酸分别于4℃和20℃保存,在第6、12、18、24天各检测1次并记录结果;第3组和第4组样本的核酸与扩增试剂混合组成反应体系,再分别于4℃和20℃保存,在第4、8、16小时各检测1次并记录结果。所有结果用循环阈值(即Ct值)表示。核酸保存后的各次检测结果与其初始结果进行比较。结果磁珠法提取SARS-CoV-2核酸于4℃和20℃保存24 d内各次检测结果与初始结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05);磁珠法提取SARS-CoV-2核酸与扩增试剂混合后,于4℃和20℃保存16 h内各次检测结果与初始结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论4℃或20℃保存条件下,磁珠法提取SARS-CoV-2核酸至少可以稳定24 d,与试剂混合后至少可以稳定16 h。

不同的核酸提取方法在布鲁氏菌检测中的应用评价

目的比较不同核酸提取方法对布鲁氏菌检出率的影响,为布鲁氏菌核酸快速提取检测提供技术参考。方法分别使用磁珠法、直接裂解法和高温裂解法对感染布鲁氏菌患者的20例全血样本、10例关节腔及浆膜腔积液样本进行核酸提取,然后进行实时荧光RT-PCR检测,采用SPSS 22.0对结果进行统计分析,评价该核酸快速提取试剂的DNA提取效率。结果磁珠法阳性检出率为100%,Ct值中位数为29.17(21.19~31.33),批内变异系数(CV)最高为1.33%。直接裂解法阳性检出率为63.33%,Ct值中位数为33.29(28.69~34.54),批内CV最高为1.28%。高温裂解法阳性检出率为100%,Ct值中位数为30.26(26.63~33.85),批内CV最高为1.21%。高温裂解法和磁珠法检出率比较差异无统计学意义(P>0.05),直接裂解法检出率显著低于磁珠法和高温裂解法(P<0.05)。结论核酸快速提取试剂在高温裂解条件下可保证核酸提取效率和重复性稳定,具有操作简单、检测时间短、降低实验室生物安全风险等优势,可以应用于布鲁氏菌的核酸检测。

磁珠快速核酸提取法在南美白对虾病原检测中的应用及其性能评价

为实现南美白对虾相关病原核酸快速、便捷提取,并实现原材料国产化,降低成本,建立了一种基于国产磁珠的核酸快速提取方法(以下简称磁珠法).以携带虾肝肠胞虫的南美白对虾为实验样本,通过微流控芯片对3种磁珠提取的核酸进行测试,并对裂解液中盐酸胍浓度及洗涤液2中乙醇浓度进行了优化.通过优选实验确定:奥润磁珠提取效果优于其他两种磁珠;裂解液中盐酸胍的最佳浓度为4 mol·L^(-1);洗涤液2中乙醇的最佳质量分数为75%.在此基础上,分析评价了优化后的磁珠法核酸提取线性范围、灵敏度、精密度、特异性及抗干扰能力等技术性能.结果显示:稀释10^(4)倍后的低浓度病原核酸仍保持较好的扩增效果,变异系数为2.03%,表明建立的磁珠法具有较宽的检测范围,灵敏度高,特异性和抗干扰能力强.本文建立的磁珠法可实现快捷、通用、高纯度、低成本的南美白对虾主要病原的核酸提取.

磁珠法核酸自动提取温度控制系统设计

针对自主设计的基于纳米磁珠的自动核酸提取系统设计了温度系统,主要包含系统温度控制算法分析、硬件电路设计及相关软件设计;系统温度采用全加热和在固定频率及占空比PWM波控制下间歇性加热的分段控制,通过实验确定全加热时间及PWM波的占空比,并建立知识库,可以满足使用多种磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取的温度要求;用该系统为河南惠尔纳米科技公司试剂盒中裂解液及洗脱液加热,实验发现,裂解时8个裂解孔的最大温度差异小于6℃,洗脱时8个洗脱孔的最大温度差异小于5℃,均满足核酸提取实验时对温度的要求。

磁珠核酸提取方法在血浆EBV-DNA实时荧光定量PCR检测中应用的性能评价

目的评价磁珠核酸提取方法在血浆EB病毒DNA(EBV-DNA)实时荧光定量PCR检测中应用的性能。方法采用自动化磁珠法提取核酸,并结合实时荧光定量PCR测定EBV-DNA,利用第三方定值参考物质评价该方法的检测性能。同时选取100例鼻咽癌患者,分别用磁珠法与煮沸法定量检测其血浆EBV-DNA,比较分析两种方法的相关性。结果基于自动化磁珠法的实时荧光定量PCR系统检测EBV-DNA,其低、中、高水平的重复性精密度均<3/5 TEa(TEa=靶值±0.4 lg),中间精密度<4/5 TEa;在5.4×101~5.4×10~5U/mL范围内具有良好的线性;最低检测限约为3.334×10~1U/mL;样本中Hb干扰物浓度低于8.667 g/L,对磁珠法检测结果无明显影响。磁珠法与煮沸法的检测结果呈线性相关,阴阳性符合率为83%。结论采用自动化磁珠核酸提取方法结合实时荧光定量PCR检测血浆EBV-DNA,具备良好的检测性能。

MPure-12全自动核酸纯化仪与Chelex-100法的比较

目的通过对DNA含量不同的血痕和多种类型生物学检材进行DNA提取和STR分型检测,探讨MPure-12全自动核酸纯化仪(MPure-12法)在DNA提取中的法医学应用价值。方法收集血痕、精斑、唾液等9种类型的生物学检材,应用MPure-12法和传统Chelex-100法提取DNA,经过PCR扩增和电泳,获取STR分型图谱。结果 MPure-12法对发根、口香糖、烟蒂、肌肉组织、唾液斑、血痕、精斑这些检材能够成功分型,唾液出现了个别等位基因丢失现象,接触拭子分型较差。Chelex-100法对血量为20μL、15μL、10μL、5μL、1μL制成的血痕均有完整分型结果,MPure-12法在血量为1μL时出现等位基因丢失现象。结论 MPure-12法适用于一定浓度血样的检验,而对于微量血样,Chelex-100法提取DNA的效果可能更优。仪器应用于DNA提取具有操作简单、快速、提取效率高,分型成功率高,减少人为污染等优势。

基于微通道多向阀自动化快速提取DNA的研究

核酸的高效分离与纯化对于下游分子诊断具有至关重要的影响.本研究基于磁珠法提取原理设计出快速、自动化核酸提取系统,利用步进电机和注射泵组成的移液装置通过微通道连接多向电磁阀完成核酸裂解、洗涤、洗脱、纯化,通过大鼠主动脉内皮细胞进行核酸提取和扩增,对核酸加热裂解时间进行优化.结果表明,当裂解时间大于4 min时,核酸纯化效果最好,磁珠回收率可达96.5%,紫外吸收光比值大于1.8,同时整个自动化提取仅需8 min.通过微通道多向阀与核酸提取技术纯化后的核酸可直接用于扩增实验,且与手动提取相比聚合酶链式反应的Ct值起跳更早,有利于后续集成核酸检测一体化系统.

磁珠法和煮沸法核酸提取在HPV-DNA分型中的比较

目的比较基于Pre-NAT全自动核酸提取系统的磁珠法与基于手工的煮沸法核酸提取在人乳头瘤病毒(HPV)-DNA分型中的应用。方法收集96份宫颈脱落细胞标本用于两种DNA提取方法检测结果的比对;利用同一混合阳性标本分装后加入系列水平的血红蛋白(Hb),评价抗Hb干扰能力;收集30份临床棉拭子标本,分析两种方法对皮肤破溃或男性生殖道分泌物DNA的提取效率。结果 96份临床标本,两种方法检测结果一致率为91.7%(88/96);磁珠法内参Globin及HPV各亚型的信号值均显著高于煮沸法(t=8.807、4.676,P<0.05)。Hb水平>17g/L时煮沸法HPV-DNA分型失败,而磁珠法信号值不受Hb干扰。30份棉拭子标本,磁珠法和煮沸法检测成功率均为80.0%,阳性率分别为54.2%、41.7%(P=0.564)。结论相比手工提取的煮沸法,基于Pre-NAT全自动病毒核酸提取系统的磁珠法具有操作简便、规范、通量高等优点。两种方法具有一定可比性,磁珠法核酸提取效率高于煮沸法,且不受Hb干扰,更适于临床应用。

基于全自动核酸提取的荧光定量PCR鉴别羊肉制品真伪

目的建立一种基于自动化的快速核酸提取方法,联合三重实时荧光定量PCR技术,鉴别羊肉制品的真伪。方法分别采用全自动核酸提取法、磁珠手提法与柱提法对不同状态羊肉制品进行核酸提取,比较不同方法的提取时间差异,通过三重实时荧光定量PCR扩增结果评估不同方法的提取效果。以GB/T38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》为对照,对市售的羊肉制品进行平行检测,评估本方法的检测性能。结果与磁珠手提法、柱提法相比,全自动核酸提取法的提取时间缩短了15~30 min,且提取的核酸扩增效果更好。全自动核酸提取法在羊猪混合样品中羊源核酸检出限为0.010mg/g。全自动核酸提取法在生鲜肉、生肉及熟肉制品等多种类型产品中提取的羊源核酸PCR检测结果的变异系数(coefficient of variation,CV)均小于3.000%。分别采用三重实时荧光定量PCR法与GB/T38164—2019对全自动提取的21份市售的涵盖不同类型的羊肉制品核酸进行平行检测,符合率为100.00%。结论本研究方法可为羊肉制品掺假的快速真伪鉴别提供操作简便、稳定灵敏、快速准确的整套解决方案。

用于磁珠法核酸提取的微流控芯片及自动化平台

基于磁珠法核酸提取原理,设计并制作出旋转驱动式核酸提取微流控芯片及自动化平台。微流控芯片包括裂解腔、清洗腔以及洗脱腔等结构,步进电机带动微流控芯片旋转,通过电磁铁吸附微流控芯片内的磁珠,实现磁珠在各腔室转移,完成核酸提取和纯化。对芯片表面疏水性、磁力大小、磁珠分散程度以及核酸洗脱时间进行优化。结果表明,当磁力大小为250 N时,可实现磁珠转移;磁铁放置于芯片上方1 mm时,腔室内磁珠分散程度最好。洗脱时间为20 min时,芯片上提取大肠杆菌的核酸浓度较高。微流控芯片与磁珠核酸提取技术相结合提取的核酸样本,可直接应用于后续聚合酶链式反应扩增环节,有利于实现核酸自动提取及扩增的一体化。

4种全自动核酸提取仪提取全血DNA效率的比较

目的比较4种全自动核酸提取仪在全血基因组检测中的核酸提取效果。方法分别用4个厂家的全自动核酸提取仪按预定的提取程序自动执行全血核酸提取,并与本实验室手工提取的核酸进行纯度和浓度比较。结果 4种全自动核酸提取仪提取全血核酸的260/280值均满足纯度1.7~2.0要求,并且核酸提取浓度高于本实验手工提取法或与本实验室手工提取法相当。结论 这4种全自动核酸提取仪提取效果优,自动化程度高,能满足临床标本应用。

磁珠法在提取核酸HIV-RNA检测中的应用研究

目的 观察评价分析磁珠法在提取核酸HIV-RNA检测中的应用效果。方法 选择2017年7月至2019年3月期间中山市第二人民医院爱心门诊经确诊艾滋病毒感染并接受抗病毒治疗的患者100例,运用磁珠法分离提取纯化核酸,荧光定量PCR检测系统及柱提取核酸荧光定量PCR检测系统测定病毒核酸HIV-RNA载量;随机对照试验分为两组,对患者的血清标本进行检测,对照组50例给予酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测HIV抗体,观察组50例给予磁珠法检测HIV抗体,并比较两组患者的检测准确率、敏感度及特异性。结果 观察组的检测准确率为96.00%,显著高于对照组的68.00%(χ^2=13.2791,P=0.0000);观察组检测敏感度与特异性分别为100.00%、100.00%,显著高于对照组的21.43%、18.18%(χ^2=36.2353、30.4615,均P<0.05)。结论 运用磁珠法分离提取纯化核酸,荧光定量PCR检测系统及柱提取核酸荧光定量PCR检测系统测定病毒核酸HIV-RNA载量,在艾滋病血清HIVRNA检测中,磁珠法的临床检测准确率、特异性、敏感度得到大幅度提高,在检测操作时方便、快捷、高效,值得临床检验科医师大力推广应用。

磁珠法提取化妆品中铜绿假单胞菌核酸的研究

目的建立一种基于磁珠法的快捷、简便、高纯度的化妆品中铜绿假单胞菌核酸的提取方法。方法采用正交实验设计法,对磁吸提取法过程中蛋白酶K的量、裂解时间、裂解温度、磁吸时间和洗脱时间进行多因素考察。结果得出最佳方案为裂解时间15分钟,磁吸时间40秒,裂解温度37℃,蛋白酶K的量为20μL,洗脱温度70℃。结论本研究建立了一种化妆品中铜绿假单胞菌核酸的快速、简便、有效的提取方法,可为化妆品中致病菌的检测提供实验基础。

乙肝病毒DNA检测2种不同核酸提取方法的性能验证情况分析

目的:对乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测的2种不同核酸提取方法,即手工法(煮沸法)和全自动核酸提取仪法(磁珠法),在使用相同的检测试剂和核酸扩增仪的条件下进行性能验证,以评价其验证结果。方法:依据《医学实验室质量和能力认可准则》《全国临床检验操作规程》等相关文件,由同一操作人员应用中山达安公司生产的HBV-DNA检测试剂盒和ABI7500实时荧光核酸扩增仪,分别采用手工法和全自动核酸提取仪法提取HBV-DNA进行临床样本的批内精密度、批间精密度、正确度、线性范围性能验证实验。结果:手工法的高值血清批内精密度为2.18%,低值血清批内精密度为3.76%;高值质控品批间精密度为3.29%。全自动核酸提取仪法的高值血清批内精密度为1.78%,低值血清批内精密度为2.44%;高值质控品批间精密度为2.84%。正确度验证分别取浓度为2.0×10^3、2.0×10^4、2.0×10^5、2.0×10^6copies/ml的可溯源标准品进行验证,手工法偏倚分别为-4.88%、-2.51%、-2.46%,-2.12%,全自动核酸提取仪法偏倚分别为-2.37%、-0.95%、0.74%、-1.33%。线性范围验证中,手工法和全自动核酸提取仪法的相关系数分别为0.9660、0.9858,均能满足临床检测的需求。结论:全自动核酸提取仪法较手工法提取核酸有利于简化HBV-DNA提取流程,实现分子生物实验室自动化提取核酸。

三种核酸提取方法检测丙肝HCV-RNA定量的比较

目的比较及评价3种不同核酸提取方法检测HCV-RNA结果的差异。方法依照美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP9-A2文件规定,收集40个新鲜血清标本,分别使用磁珠法、柱提法、手工法丙肝试剂以及Roche试剂进行平行检测,记录测定结果,计算线性方程及相关系数,并对其进行偏倚评估。结果磁珠法和柱提法试剂与Roche试剂方法间的相关性良好(r>0.975),而手工法与Roche试剂方法检测结果间差异超出预设允许误差范围。结论各方法学的试剂与Roche试剂检测结果大致相关性尚可,其中磁珠法结果较好。

溶血和黄疸标本对不同核酸提取方法影响的比较

目的比较溶血和黄疸标本对磁珠法、一步法和沉淀煮沸法三种不同核酸提取方法 HBV DNA检测结果的影响。方法制备含有不同浓度梯度血红蛋白或总胆红素的血清,使其HBV DNA浓度相同;检测过程中除核酸提取方法不同外,其余操作完全相同,进行实时荧光定量PCR检测,比较三种核酸提取方法对不同程度的溶血和黄疸标本的抗干扰能力。结果当Hb≤0.5g/L时,3种方法均不受影响,Hb=5.0g/L时,一步法与沉淀煮法呈假性升高,磁珠法受影响不明显;Hb=50.0g/L时,3种方法均受影响明显,一步法与沉淀煮沸法可被抑制呈阴性。不同浓度的总胆红素对磁珠法与沉淀煮沸法无明显影响,对一步法产生的影响显著,其检测结果可通过调整结果判断部分参数得到修正。结论在相同检测条件下,磁珠法对溶血和黄疸的抗干扰能力最好,沉淀煮沸法次之。

磁珠法在120例丙型肝炎病毒核酸定量检测中的应用效果观察

[目的]观察磁珠法在丙型肝炎病毒核酸定量检测中的应用效果.[方法]选择自2018年1月至2020年1月间采集的120例丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒(HCV)血清标本,其中低病毒载量22例,中病毒载量64例,高病毒载量34例,采用提取柱法与磁珠法核酸定量检测,根据浓度1×10^(8)样本梯度稀释结果比较2种核酸定量检测方法的灵敏度和线性范围.[结果]磁珠法HCV核酸定量检测阳性率为70.0%,与提取柱法的66.7%比较差异无统计学意义(P>0.05);22例低病毒载量的HCV血清标本磁珠法检测阳性率为40.9%,明显高于提取柱法的9.1%(χ^(2)=5.9394,P=0.0148);磁珠法灵敏度和线性范围分别为39 U/mL和3.9×(10^(1)~10^(8)),与提取柱法比较差异有统计学意义(P<0.05).[结论]磁珠法与提取柱法在中、高病毒载量的检测中一致性较好,在低病毒载量的检测中磁珠法较提取柱法核酸定量检测的灵敏度更高,线性范围更广.

两种核酸提取方法检测丙肝HCV-RNA定量的比较

目的:比较两种HCV-RNA核酸提取试剂对丙肝RNA病毒定量检测结果的差异,选出符合临床实验室要求的方法。方法:本实验从佛山市第一人民医院Roche全自动核酸分析已检测患者样本中选取浓度梯度分布均匀的阳性标本30例,分别使用中元磁珠法和达安磁珠法两种方法进行核酸提取,同时使用达安手工法进行平行实验,采用实时荧光定量PCR技术进行扩增和产物分析,利用统计学方法评价中元磁珠法和达安磁珠法两种核酸提取方法检测结果的正确度以及与达安手工法检测结果的一致性。结果:两种核酸提取方法检测丙肝HCV-RNA定量结果的正确度均可接受,中元磁珠法与达安手工法的一致性不及达安磁珠法与手工法的一致性好。结论:达安磁珠法正确度及与手工法的一致性更符合临床实验室的要求。