ABI3130xl全自动测序仪规模化测序的影响因素研究

【目的】提高利用ABI3130xl全自动测序仪对小麦与条锈菌互作的cDNA文库进行大规模测序的成功率,降低成本。【方法】将BigDye(BigDye(Teminator V3.1 Cycle Sequencing RR-100)分别稀释16,24和32倍设计测序的PCR反应体系,分析了EDTA溶液(125 mmol/L,pH 7.0)和醋酸钠溶液(3 mol/L,pH 5.2)以及不同模板类型等相关因素对测序结果的影响。【结果】BigDye稀释16倍的PCR反应体系的测序结果易出现染料峰,影响碱基正确读值;稀释32倍体系的测序结果中可用序列短,成功率低;稀释24倍体系测序结果的可用序列长且准确率高,为最佳反应体系。EDTA溶液和醋酸钠溶液可提高DNA纯化的质量,改善测序效果。以质粒DNA为模板测序较PCR产物直接测序效果好,通过控制模板质量可以提高测序成功率。【结论】利用优化体系共测得15 000条ESTs序列,其中有高读长序列13 080条,占87.2%,表明该优化体系简单有效,且可有效节约成本。

全自动测序仪PCR产物测序影响因素研究

目的对影响ABI3500xl全自动测序仪测序过程的因素进行研究,以提高测序的准确度和成功率并降低成本。方法对PCR反应体系、产物纯化方法进行优化。将Big Dye分别稀释8、16和32倍进行测序PCR反应,比较不同的Big Dye稀释倍数对PCR产物测序结果的影响;使用CENTRI-SEP柱纯化法、Big Dye Cleaning Beads磁珠法和乙醇乙酸钠EDTA法对测序PCR产物进行纯化,比较不同纯化方法对测序结果的影响。结果 Big Dye稀释8倍和16倍时,PCR反应体系的测序结果正常,而稀释32倍时测序结果出现碱基误读;3种不同的测序PCR产物纯化方法均可得到满意的测序结果。相比之下,CENTRI-SEP Kit纯化方法所需时间最短(0.5 h),但是成本较高;乙醇乙酸钠EDTA纯化方法成本最低,但耗时较长(2 h);磁珠纯化法所需时间(1 h)和成本介于CENTRI-SEP Kit法和乙醇乙酸钠EDTA法之间,但不适于高通量操作。结论 ABI3500xl全自动测序仪测序过程中,Big Dye稀释16倍时所得测序结果准确且成本较低;3种测序PCR产物纯化方法均可得到准确的测序结果 ,实际工作中应根据操作者具备的实验条件选择最适纯化方法 ,以减少测序时间和成本。