基于全菌消减SELEX技术的体外筛选大肠埃希菌O157:H7适配体研究

目的筛选出能特异性识别大肠埃希菌O157:H7的单链DNA(ss DNA)适配体并进行鉴定。方法利用全菌消减SELEX技术,以完整菌体为靶标菌和消减菌,通过体外筛选方法筛选出大肠埃希菌O157:H7特异性ss DNA适配体。利用荧光分光光度计、激光共聚焦显微镜、克隆测序、Chromas和DNAMAN分析软件,分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行特异性鉴定。结果经过7轮全菌消减SELEX筛选,荧光分光光度计检测结果鉴定第六轮文库富集达到饱和;通过测序分析、荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜特异性检测,获得1条与大肠埃希菌O157:H7特异性结合的适配体Aptamer1。结论利用全菌消减SELEX技术成功筛选获得大肠埃希菌O157:H7特异性ss DNA适配体。

琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV P24抗原适配体

建立以羧基化琼脂磁珠为筛选介质,快速筛选高特异性、高亲和力的HIV P24抗原适配体的方法.利用消减SELEX技术及靶标替换的方法,以HIV P24抗原作为靶分子,羧基化琼脂磁珠为载体,进行6轮筛选,筛选到3条特异性核酸适配体.特异性检测表明,筛选得到的HIV P24抗原适配体与HIV P24抗原的结合解离常数均在纳摩尔级水平.该方法为HIV早期检测提供了新的检测技术,对适配体与靶分子相互作用机理的研究具有重要价值.

琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV gp41抗原适配体（英文）

目的通过消减SELEX技术筛选得到高特异性、强亲和力的HIV gp41抗原适配体,为HIV的早期诊断提供了新的检测技术。方法以琼脂磁珠为载体,HIV gp41抗原为靶标分子,利用消减SELEX技术和实时定量-PCR技术,筛选得到HIV gp41抗原适配体。结果通过6轮筛选,筛选得到的次级ss DNA库通过PCR扩增得到ds DNA,ds DNA与p MDTM 18载体链接,进行克隆、测序,获得4条HIV gp41抗原适配体。获得的4条适配体亲和力(Kd)均在纳摩尔水平,其中15号适配体的亲和力最强,特异性检测表明筛选得到的适配体几乎只与HIV gp41抗原结合,不与其他非特异性蛋白结合。结论利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与HIV gp41抗原特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗HIV gp41抗原的能力。

改良SELEX技术筛选福氏志贺菌2a特异性适配体

目的:构建与福氏志贺菌2a高亲和性、特异性结合的DNA寡核苷酸适配体库。方法:体外合成76 nt高通量随机序列的单链DNA寡核苷酸文库(ssDNA),运用全细菌指数富集的配体系统进化技术(whole-bacteria SELEX),福氏志贺菌2a作为靶标与文库ssDNA反应;通过优化PCR反应,将Lambda酶外切及葡聚糖凝胶层析纯化技术用于次轮反应文库的制备,荧光分光光度计跟踪筛选过程,流式细胞仪克隆测序特异性单链核酸适配体,生物信息学技术分析其一、二级结构。结果:经过PCR技术10轮正向筛选和6轮消减菌筛选,通过Lambda酶外切及葡聚糖凝胶层析纯化,ssDNA平均回收率高达72.33%。依据一级结构的同源序列建立了36个寡核苷酸探针组群。流式细胞仪分析获得1条与福氏志贺菌2a特异性结合的适配体(命名ZH-21)。结论:基于全菌消减SELEX技术,结合Lambda酶外切及凝胶层析纯化技术,建立一种快速、稳定、高效、特异性高和成本低的筛选福氏志贺菌2a特异性单链核酸适配体的方法。

应用抑制消减杂交技术研究鼠疫菌与假结核菌基因组之间的差异

目的:研究古典型鼠疫菌与假结核菌ATCC29833基因组间的差异,为进一步认识鼠疫菌的起源与进化奠定基础。方法:通过抑制消减杂交技术比较两种细菌基因组间的差异。结果:与已测序的 3株鼠疫菌基因组进行同源性比较,发现了 259个假结核菌基因组中存在的特异序列,与基因库进行同源性比较发现了 10个假结核菌ATCC29833基因组中存在的新序列。结论:抑制消减杂交技术是一个简单而有效的比较近源微生物基因组之间差异的方法,鼠疫菌在进化过程中失去了大量的基因,假结核菌基因组之间也存在着一定的差别。

基于全菌SELEX技术副溶血性弧菌适配体筛选及鉴定

目的筛选并鉴定可用于实验室快速检测副溶血性弧菌的适配体序列。方法利用全菌SELEX技术,通过人工合成全长86 bp、中间含40 bp随机核苷酸序列的单链DNA文库,筛选与副溶血性弧菌高效结合的适配体,对候选适配体序列进行特异性分析,并评估其二级结构和Kd值。结果第4轮筛选即出现比较明显的产物富集,继续筛选至第12轮结束。经克隆和测序后得到5条候选适配体序列(F2、F5、F6、F19、F30),它们与副溶血性弧菌的结合率分别为68.8%,68.8%,73.1%,65.2%和72.7%;特异性实验显示,5条候选适配体均能与副溶血性弧菌高效结合,与5种其它常见致病菌则结合不明显;用DNA folding form对5条候选核酸适配体序列进行二级结构模拟,结果显示,其二级结构以茎环(凸环和圆环)为主,茎环结构中的茎多由G-C配对组成;采用荧光分析法对5条候选适配体的Kd值进行分析测定,其对靶细菌的解离常数分别为15.88、15.24、9.13、4.12和25.39 nM。结论全菌SELEX技术可用于副溶血性弧菌适配体筛选,5条候选适配体与靶细菌结合力强,特异性高。

癌胚抗原特异性单克隆抗体(Anti-CEA)核酸适配体的筛选

目的 :筛选癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)特异性单克隆抗体(Anti-CEA)的核酸适配体(aptamers),为肺癌血清肿瘤标志物核酸适配体的筛选奠定实验基础。方法:利用羧基化琼脂磁珠作为筛选介质,以Anti-CEA为筛选的目标靶分子,通过消减SELEX技术及实时定量PCR技术,从随机ss DNA文库中筛选出与Anti-CEA特异性结合的aptamers,并通过凝胶阻滞实验(EMSA)鉴定筛选到的Anti-CEA-aptamer复合物,然后将得到的第10轮富集文库扩增为双链DNA,通过切胶纯化后,连接PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,同时利用交错PCR技术鉴定阳性克隆,经测序,获得aptamers的序列。结果:经过10轮筛选得到了4条与Anti-CEA结合的aptamers,测序结果显示均为不同序列。结论:验证筛选出的与Anti-CEA结合的aptamer,特异性检测结果表明2号aptamer与靶分子结合的特异性很高,且与非特异蛋白无明显吸附,筛选出的aptamers用于识别Anti-CEA,将为肺癌的早期诊断和早期治疗提供新的突破口。

肺癌患者血清特异性核酸适配体的筛选及鉴定

目的以磁珠为筛选介质,利用实时定量-PCR和消减SELEX技术从肺癌血清中筛选得到高特异性、强亲和力的肺癌血清核酸适配体。方法以磁珠为载体、肺癌病人血清为筛选的靶标分子,通过消减SELEX技术及实时定量PCR技术,从随机ss DNA文库中筛选出与肺癌血清特异性结合的aptamers,将得到的第9轮富集文库扩增为ds DNA,送上海生工直接对筛选得到的核酸适配体库进行高通量测序。结果经过9轮筛选得到4条与肺癌血清高特异性结合的aptamers,测序结果显示均为不同序列。结论验证筛选出的与肺癌血清结合的aptamer,特异性检测表明,筛选得到的肺癌血清核酸适配体与肺癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq-2、Seq-3、Seq-6、Seq-19号核酸适配体能高特异性结合肺癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肺癌血清和200例正常人血清进一步鉴定4条肺癌血清核酸适配体检出肺癌的阳性率,阳性检出率达91%以上,为肺癌的早期诊断提供了新方法。

CA125抗原核酸适体的筛选及鉴定

目的建立一种基于核酸适体快速检测肿瘤血清标志物CA125抗原的方法。方法以CA125抗原为筛选靶标,CA199抗原为反筛选靶标,羧基化琼脂磁珠为筛选介质,利用指数级富集配体的系统进化技术筛选其高特异性核酸适体,利用生物信息学方法对核酸适体进行序列分析和二级结构预测,荧光定量法分析核酸适体的亲和力,ELONA法测定核酸适体的特异性。结果经过6轮消减SELEX筛选,次级ssDNA文库的亲和力逐渐提高,特异性次级ssDNA文库逐轮富集,经二代测序,获得3条拷贝数>1000的核酸序列(Apt-1、Apt-2、Apt-3),可特异性识别CA125抗原,测定Kd值,分别为41.02±4.9、19.06±9.0、10.02±5.0 nmol/L,Apt-3亲和力最高。结论功能性核酸适体Apt-3能高特异性识别CA125抗原,为肿瘤血清标志物CA125检测提供了一种新的、快速、有效的工具和手段。