适合双向电泳的大白菜花蕾蛋白提取及浓度测定方法

高质量提取大白菜花蕾蛋白是大白菜花器官蛋白质组学研究的关键步骤。本试验以大白菜AB01可育花蕾为材料,采用TCA丙酮沉淀法、Tris-HC1法、酚改良法、Trizol沉淀法、Tris-丙酮-酚法和尿素-硫脲提取法等六种方法分别提取花蕾全蛋白,通过Bradford法和双向电泳蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,经双向电泳分离后得到2-DE图谱,经分析、比较图谱蛋白点的情况,找到花蕾全蛋白的最佳提取方法和浓度测定方法。结果显示:TCA丙酮沉淀法得到的2-DE图谱,蛋白点分布均匀、清晰,是一种较为理想的花蕾蛋白提取方法;采用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度更加准确。

褐色橘蚜全蛋白双向电泳体系条件优化

为优化有效分离褐色橘蚜Toxoptera citricida全蛋白的双向电泳体系,比较了饱和酚抽提法、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)/丙酮沉淀法、直接裂解液法和Tris-HCl法4种蛋白提取方法,以及蛋白上样量、聚焦条件和固相p H梯度(immobilized p H gradient,IPG)胶条对褐色橘蚜全蛋白双向电泳的影响。结果表明,TCA/丙酮沉淀法和直接裂解液法获得的全蛋白浓度分别为4.25、4.03μg/μL,显著高于饱和酚抽提法和Tris-HCl法,且TCA/丙酮沉淀法所提取的蛋白种类丰富度最高。采用TCA/丙酮沉淀法获得全蛋白,当上样量为100μg时,所得蛋白质点多、分辨率高、背景清晰,除盐3 h,等电聚焦量45 000 V·h,并选用p H 3~10非线性IPG胶条时,双向电泳图谱中横向拖尾现象少,蛋白点相对清晰,分布均匀。表明所建立的双向电泳体系,结合银染,可从褐色橘蚜全蛋白中识别出1 264个蛋白点,且重复性研究匹配率高,可用于褐色橘蚜蛋白质组学研究。