应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库

目的应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库。方法采集登革确诊患者恢复期外周血,分离外周血淋巴细胞并提取其总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库;将抗体基因库转染CHO细胞、用流式细胞仪分析抗体在CHO细胞表面的表达。结果以1.2μg总RNA为模板,用6套引物扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,轻链基因库容量为1.45×104,重链基因库容量为1.8×105;随机挑选的10个轻链克隆和10个重链克隆,经过测序鉴定,轻链有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列,重链有7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析含有正确阅读框架的单克隆和抗体基因库,均检测到全长抗体在CHO细胞表面的表达,抗体库中可表达的抗体多样性达到109。结论以1.2μg总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,成功构建可表达库容量达到109的登革病毒特异性全长人抗体基因库。

快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库

目的快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库。方法分离外周血淋巴细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体重链可变区(VH)和全长Kappa型轻链(LCκ)基因库,分别插入载体pDGB-HC-TM,化学转化感受态大肠杆菌DH5α,构建抗体的轻、重链基因库,然后将其联合转染CHO细胞,流式细胞仪分析全长人源抗体在CHO细胞表面的表达。结果构建的非特异性IgG1-Kappa抗体基因库,重链库容量达2.6×105,轻链库容量达2.0×105,理论库容量高达5.2×1010。随机从重链库和轻链库各挑选10个克隆送测序,重链10个克隆的DNA序列分析显示8个含有正确的阅读框架,轻链10个克隆的DNA序列分析显示全部含有正确的阅读框架。流式细胞仪分析显示来自轻链库的10个克隆、重链库的8个克隆均可检测到抗体在CHO细胞表面的表达。用所构建的轻重链抗体库共转染CHO细胞,流式细胞仪分析可检测到抗体在细胞表面的表达,阳性细胞比例达到31.5%,说明所构建的抗体库能够在CHO细胞表面成功展示全长抗体。结论采用本研究建立的哺乳动物细胞展示技术,可在2周内成功构建库容量大且多样性好的全人源抗体基因库,用于高亲和力特异性抗体的筛选。

系统性红斑狼疮儿童特异性全长抗体基因库的构建与分析

目的构建系统性红斑狼疮(SLE)儿童个体特异性哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库。方法采集SLE确诊患儿外周血,分离外周血淋巴细胞,提取外周血淋巴细胞总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因、构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库,将抗体基因库转染293T细胞,流式细胞仪分析抗体在293T细胞表面的表达。结果以0.8μg总RNA为模板,用6套引物成功扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,构建获得的重链基因库容量为9.4×104,轻链基因库容量为8.4×104。随机挑选的10个重链克隆有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列,10个轻链克隆7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析挑选的单克隆和抗体基因库,均检测到全长抗体在293T细胞表面的表达,理论上抗体库中可表达的抗体多样性可以达到109。结论以0.8μg总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,成功构建SLE儿童特异性全长人抗体基因库,并在293T细胞表面成功展示SLE儿童个体抗体库中的全长抗体,为进一步研究SLE儿童自身抗体的特点及自身抗体在SLE发病机制中的作用及临床应用打下良好基础。

应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建动脉粥样硬化抗体库

目的:利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建动脉粥样硬化(As)抗体细胞库,以寻找动脉粥样硬化治疗性抗体。方法:将载体pcDNA5/FRT改造成双表达载体pcDNA-DHL。分离动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞,提取总RNA,逆转录为cDNA。PCR扩增抗体重链可变区和Kappa型轻链全长,连接至双表达载体pcDNA-DHL,即动脉粥样硬化抗体基因库pDHL-As,将其转染Flp-In TM-CHO细胞(FCHO),流式细胞术检测重组抗体在细胞表面的表达。加入潮霉素筛选出成功转染pDHL-As载体的细胞,即为动脉粥样硬化全长抗体细胞库。结果:成功构建双表达载体pcDNA-DHL。构建的重、轻链初库容量分别达1.79×10^5和1.80×10^5,理论上抗体库多样性为2.32×10^10。动脉粥样硬化抗体库pDHL-As可成功展示在细胞表面,并分选出45个表达抗氧化型低密度脂蛋白抗体的FCHO细胞。结论:本研究成功构建了一个动脉粥样硬化全长人源抗体细胞库。