生物信息学在新基因全长cDNA序列分析及功能预测中的应用

差异表达基因的检测与分析已成为研究具有差异的生物学表型的常规策略 .对通过实验所获得的差异基因片段进行生物信息学分析 ,主要包括基于国际互联网的序列相似性分析、片段重叠群分析和全长cDNA序列分析 ,以及如何构建局域网并采用本地服务器进行规模化的数据分析 ,从而为研究人员提供可参考的生物信息学数据分析方案 .

利用交错延伸剪接PCR技术扩增油菜花粉育性基因MS2 Bnap全长cDNA序列

交错延伸剪接PCR是一种用于分子进化研究的DNA改组技术。本实验利用其原理 ,将已获得的油菜花粉育性基因MS2Bnap有部分序列重叠的三段PCR产物作为模板进行扩增 ,获得了花粉育性基因MS2Bnap的全长cD NA序列。

人脑红蛋白(NGB)全长cDNA序列的克隆

人脑红蛋白 (neuroglobin ,NGB)是新发现的神经系统特异的携氧蛋白 ,然而其全长cDNA序列一直未见报道 .采用电子序列延伸技术和cDNA序列末端快速扩增技术 (rapidamplificationofcDNAends ,RACE)研究发现 ,人NGB全长cDNA序列为 190 9bp,5′非编码区为 375bp ,编码区 (45 6bp)可编码 15 1个氨基酸 ,3′非编码区为 10 78bp,其中含 2 7bp的 poly (A) (GenBank接受号 :AF4 2 2 797) .综合采用电子序列延伸技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法 ,为后续的功能研究提供了重要基础 .

日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列基因的全长cDNA序列分析

目的对带有信号序列的日本血吸虫虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列进行分析。方法根据日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列的cDNA片段序列设计合成基因特异性引物。以虫卵的第一链全长cDNA为模板,采用套式PCR,快速扩增带信号序列的虫卵毛蚴cDNA的5′、3′末端片段,将特异性扩增片段进行TA克隆与序列分析。将每个带信号序列的虫卵毛蚴cDNA片段序列与其5′、3′末端片段序列进行比对和拼接,构建每个带信号序列的虫卵毛蚴基因的完整全长cDNA序列,对部分带信号序列虫卵毛蚴基因的信号序列所对应的基因组序列结构进行分析。结果本研究分析了30个带有信号序列的cDNA片段,其中16个片段的5′、3′末端cDNA序列被成功扩增,并测定了它们的DNA序列,通过序列比对和拼接,获得了该16个虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列。对开放阅读框演绎的氨基酸序列进行分析,发现基因SjP4001与SjP1531的信号肽序列完全相同,而基因SjP3742和SjP1183的信号肽氨基酸序列甚为相似,从而进一步证明不同的基因可拥有相同或相似的信号肽。基因组序列分析表明,基因SjP1183的信号肽基因序列与成熟肽基因序列通过交替拼接(alternativesplicing)方式进行拼接;而基因SjP4001、SjP1531、SjP3742的信号肽基因序列与成熟肽基因序列之间可能是通过转移拼接的方式进行拼接。结论确定了16个带有信号序列的虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列,虫卵毛蚴基因可通过交替拼接方式或转移拼接方式获得信号肽序列。

中华绒螯蟹卵巢新基因EJO6的全长cDNA克隆和序列分析

利用RACE技术从中华绒螯蟹卵巢获得了新基因EJO6(Eriocheirjaponicaovarygene6,EJO6)的全长cDNA序列(GenBank检索号:AY185922).该cDNA序列长度为1250bp,开放阅读框为690bp,编码229个氨基酸.根据氨基酸序列计算的相对分子质量和等电点分别为24270和11 9.同时用生物信息学的方法对该基因的结构和功能进行了初步分析.

平颏海蛇CRVP基因全长cDNA片段的克隆和序列分析

通过对平颏海蛇毒腺ｃＤＮＡ文库的随机恻序和 ＰＣＲ筛选，克隆得到两种分别长为 １３０９和 １３０７ｂｐ的编码半胱氨酸丰富毒蛋白（ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｖｅｎｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＶＰ）的全长 ｃＤＮＡ序列．这两种ｃｒｖｐ基因同源性为９７％，分别编码２３８和１９９个氢基酸残基，其中包括一段相同的由１９个氨基酸残基组成的信号肽．氨基酸序列分析表明，这两种ＣＲＶＰ蛋白与蜥蜴ｈｅｌｏｔｈｅｒｍｉｎｅ毒素蛋白以及台湾饭铲情ＣＲＶＰ毒蛋白高度同源，而且具有半胱氨酸丰富分泌蛋白（ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＩＳＰ）家族的典型结构特征．

基于电子克隆方法获得鸡MIBP全长cDNA

随着生物数据的急剧增长和计算机技术的快速提高,生物信息学这一新兴学科得到了前所未有的迅速发展,应用的领域越来越广。应用电子克隆技术来寻找未知新基因,就是生物信息学在全长新基因发现上的具体应用。电子克隆与其他发现全长基因的方法相比可以充分利用已有的数据库资源,避免大量的重复性劳动,节省时间和开支,加快新基因的发现。在鸡的大规模cDNA克隆测序的背景下,利用EST数据库比对,应用电子克隆技术来寻找鸡的末知新基因。并成功的预测了一个EST的全长cDNA序列物(947bp),同时对其进行了蛋白质水平的预测与分析,被步确定它编码206个氨基酸,其蛋白质序列与人肉整合素结合蛋白β1具有较高相似性(相似性为73%)。经RT-PCR扩增获得预期片断,测序鉴定,命名为ChickenMIBP。

小叶锦鸡儿转录因子CBF/DREB1 cDNA全长的克隆

以旱生豆科植物小叶锦鸡儿为材料,利用RT-PCR和RACE方法克隆了CBF/DREB1基因cDNA全序列。结果表明:小叶锦鸡儿CBF/DREB1序列全长为1,022bp,包括565bp的开放阅读框(ORF),起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,包括128bp的5'UTR、279bp的3'UTR、加尾信号AATAAA和poly(A)12。

星星草cDNA文库构建和金属硫蛋白(MT-1)基因的克隆

以受NaHCO3胁迫后的星星草叶片组织为材料构建了cDNA文库,文库的初始滴度为2.0×106pfu,重组率为95%,平均插入片段长度为0.8kb,扩增后文库的滴度为4.0×109pfu·mL-1。文库克隆随机测序获得了星星草的金属硫蛋白(MT-1)基因的全长cDNA序列,显示文库中含有一定量的全长基因。MT-1基因全长622bp,其中5'非翻译区57bp,3'非翻译区343bp,开放读码框长222bp,编码73个氨基酸,氨基酸序列中具有植物MT-1蛋白特有的金属响应元件(MRE)序列,MT-1蛋白的分子量为7.814kD,理论等电点为4.72。

采用RACE技术获得全长人新基因MAGE-D1

c DNA末端快速扩增 (RACE)技术是快速获得新基因 5′和 3′端未知序列的有效手段 .鉴于新报导的人肿瘤基因 MAGE家族成员之一 MAGE- D1的 c DNA序列不完全 ,从而拟用 RACE技术获得 MAGE- D1的全长 c DNA序列 .结果显示 ,MAGE- D1的 c DNA全长为 2 80 0个碱基 ,编码778个氨基酸 .同时对 RACE技术应用时的一些关键问题进行了讨论 .

犬贾第虫病毒(长春株)全基因组序列分析

根据已报道的人源蓝氏贾第虫病毒序列设计了互相重叠的6对特异性引物,以犬贾第虫(长春株)纯培养滋养体总核酸为模板进行RT-PCR。PCR产物连接到pMD18-T载体进行测序,通过BLAST在GenBank进行同源性搜索,并用DNAMAN分子生物学软件进行分析。结果测得我国犬贾第虫病毒(长春株)基因组全长为6 276bp(DQ238861),编码1个有887个氨基酸残基的衣壳蛋白和1 056个氨基酸残基的融合蛋白,这2个阅读框被-1核糖体移码框分开,重叠处有220 nt。基因组中G+C占49.62%。其序列与国外报道的人源蓝氏贾第虫病毒(L13218)序列同源性为94.62%,编码的氨基酸同源性为93.50%;与国内人源蓝氏贾第虫病毒(AF525216)序列同源性为98.88%,编码的氨基酸同源性为98.30%。

悦目金蛛丝腺SMART RACE cDNA文库的构建与鉴定

运用SMART技术构建了悦目金蛛丝腺SMARTRACEcDNA文库。经检测,文库所含全长cDNA的长度主要集中在500bp～2000bp之间;把双链cDNA通过T/A克隆、随机挑选阳性克隆并测序后,得到1条752bp的全长cDNA序列。以该文库为模板,用依据这条全长cDNA序列设计的基因特异性引物与接头引物进行RACE,3’RACE和5’RACE的产物拼接后的全长序列与上述全长cDNA序列一致。结果表明,该文库适于用RACE方法从中分离在悦目金蛛丝腺中表达基因的全长cDNA。本文还对SMART技术的特点和局限性进行了讨论。

cDNA末端扩增技术的研究进展

cDNA末端扩增技术是一种以PCR反应为基础,快速获得已知cDNA序列3′端和5′端的方法,是克隆全长cDNA序列的主要手段之一。本文从RACE原理出发,对RACE技术3个关键步骤(反转录、TdT加尾、PCR扩增)的优化和改良措施进行了透彻分析,并详细阐述RACE的最新研究进展———“电子”cDNA克隆。

cDNA末端快速扩增技术的研究进展

cDNA末端快速扩增技术是一种基于多聚酶链式反应的技术 ,它的发展大大便利了应用其它方法获得的部分cDNA序列后克隆全长cDNA 5’和 3’末端的工作。不仅RACE方法能在短时间内得到完整的cDNA末端序列 ,而且一些截短的cDNA末端常常也能在RACE的过程中被扩增 ,而这些截短的产物破坏了全长cDNA克隆的获取。许多研究者对RACE的流程提出了改进方案 ,从而提高了该技术的效力。本文介绍了许多已发表的RACE技术关键步骤的改良 ,包括一些具体有效的操作流程 ,如RNA连接酶介导的RACE/连接锚定PCR等 ,还有其有效性的例证。

军曹鱼Igκ轻链cDNA克隆及组织表达分析

应用同源克隆和RACE技术克隆了军曹鱼(Rachycentron canadium Linnaeus)Igκ轻链的cDNA全序列,并分析其在组织中的表达。军曹鱼Igκ的cDNA全长969 bp,3′端的非编码区域(UTR)为188 bp,5′UTR为52 bp,开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸,分子量约为26.255 kD,理论等电点7.52。推测的军曹鱼Igκ恒定区氨基酸序列同(Seriola quinqueradiata)、大西洋鲑(Salmo salar)的Ig轻链同源性最高,达77%以上,可变区氨基酸序列与的相应序列同源性最高,达87%。通过构建系统进化树可以看出,军曹鱼Igκ恒定区氨基酸序列同、大西洋鲑的L3、斑点叉尾(Ictalurus punctatus)的G等鱼的轻链均为κ型的聚为一支,同大西洋鲑的L2、斑马鱼(Danio rerios)的L2、鲤(Cyprinus carpio)的L2等均为λ型的明显不同,由此可推断此序列属于Igκ型。利用半定量PCR技术,发现在健康鱼体中κ链基因在肝脏和鳃中的表达量较高,在肠和脑组织中几乎没有表达。经鲨鱼弧菌(Vibrio carchariae)JT2刺激192 h后,κ链基因在采样的各个组织中均有表达,尤其在头肾、肠、鳃和脾中的表达量较正常水平明显升高,而肝的表达量有所下降,脑组织有κ链基因的少量表达。说明经刺激后头肾、脾脏、肠、鳃是免疫球蛋白的主要表达场所,在抵御病原感染过程中发挥着重要作用。

芒果PAL基因的克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）是酚类物质合成的第一个酶，是催化苯丙烷类反应的第一酶。根据已经报道的PAL基因的序列设计兼并引物，采用3＇RACE和5＇RACE方法，克隆得到了芒果果实PAL基因的全长cDNA序列。

柽柳翻译起始因子(eIF-5A)基因的克隆及原核表达

根据柽柳cDNA文库中获得的eIF-5A基因片段,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列。cDNA长度为799bp,编码159个氨基酸。将该cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-eIF5A。不同浓度NaCl胁迫下大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(pET28a-eIF5A)比E.coliBL21(pET28a)有明显的抗盐性,前者菌株存活率在1.0mol·L-1NaCl盐胁迫下是后者的9.3倍,据此认为E.coliBL21(pET28a-eIF5A)的耐盐性可能与eIF-5A基因的表达相关。该基因的GenBank登录号为AY587771(基因)、AAT01416(蛋白)。

鲤鱼中Sox9b基因的克隆和表达

Sox9基因是一个重要的转录调控因子,参与性别决定及软骨等多种组织和器官的发育过程。本研究利用简并引物扩增鲤鱼基因组DNA,首次发现在鲤鱼中存在两种形式的Sox9基因。二者在保守盒区编码的氨基酸序列相同,并都存在一个内含子,但内含子序列差异很大,分别长704bp和616bp。在此基础上采用RACE技术克隆了鲤鱼Sox9b基因的5’端和3’端,通过拼接获得了2447bp 的全长cDNA序列,编码428个氨基酸。其中96-174位共79个氨基酸为HMG保守盒。将鲤鱼Sox9b基因与三刺鱼等九种动物的氨基酸序列相比较发现,它们的同源性高达75%以上,显示Sox9 基因在进化中较保守。应用半定量RT-PCR技术对成体鲤鱼不同组织中Sox9b基因的表达进行了分析,结果表明该基因广泛表达,尤以脑及精巢中表达最为丰富。

琥珀蚕内参基因的克隆及表达稳定性检测

琥珀蚕（Antheraea assama）是一种重要的野蚕种质资源。为了开展琥珀蚕功能基因的研究,选择合适的内参基因非常必要。通过c DNA末端快速扩增技术获得琥珀蚕功能基因研究的3个常用内参基因β-actin、GAPDH和18S rRNA的c DNA全长序列,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析3个基因在蚕体不同组织中的转录水平,并利用标准化分析软件ge Norm和Norm Finder分析其表达的稳定性。结果显示,3个内参基因的表达稳定性依次为β-actin、GAPDH、18S rRNA。就组织表达而言,β-actin在幼虫的中肠、脂肪体、马氏管、气孔、丝腺和卵巢以及蛹的输卵管中表达相对稳定;就发育时期的表达而言,β-actin在蛾期的表达也相对稳定。此外,GAPDH在幼虫头部、表皮和血液中的表达相对稳定;18S rRNA在幼虫精巢中的表达相对稳定。对琥珀蚕功能基因表达进行qRT-PCR所需内参基因数量的分析表明,选用2个内参基因即可满足试验需求。

烟草中一个LTR类反转录转座子基因的克隆与功能分析

[目的]分析烟草中LTR类反转录转座子对植物生长发育的影响。[方法]利用同源克隆及RACE的方法,从烟草栽培品种‘贵烟1号’c DNA中克隆得到了1个烟草反转录转座子的全长c DNA序列,命名为Ntrt1(Gen Bank登录号:KC899077)。利用实时定量RT-PCR研究了该基因在烟草不同组织中的表达水平;构建了基于双生病毒卫星诱导的Ntrt1的基因沉默载体,以中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)为辅助病毒在烟草中沉默了该基因,并调查了基因沉默后的表型。[结果]序列分析表明:该基因全长5 046 bp,编码3个ORF,分别为Gag/pol多聚蛋白、反转录转座子的中心蛋白以及一个整合酶。该基因能在烟草的根、茎、叶中表达,在叶片中的表达量最高。Ntrt1基因沉默烟草与对照相比,烟草植株明显变矮。[结论]Ntrt1在烟草的生长发育中具有重要作用。