SD大鼠骨髓基质干细胞的全骨髓培养与鉴定

目的:采用体外全骨髓培养法培养SD大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)并进行鉴定。方法:采用全骨髓贴壁法分离扩增大鼠骨髓基质干细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面分子CD29、CD34、CD45的表达。结果:全骨髓培养法能迅速、有效地培养和获得大量骨髓基质干细胞,流式细胞仪检测显示CD29阳性率为99.0%,CD34阳性率1.5%,CD45阳性率0.8%。结论:全骨髓贴壁培养法是获得骨髓基质干细简捷、高效、经济的途径,可以获得较纯的BMSCs。

全骨髓培养法和密度梯度离心法分离hBMSCs的比较研究

目的比较全骨髓培养法和密度梯度离心法对hBMSCs的分离效果。方法取健康成年人自愿捐赠的骨髓,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法分离、培养hBMSCs并进行传代。采用倒置相差显微镜观察原代细胞形态变化;取第2代细胞培养7d后行HE染色;对比原代及第2、3代细胞传代时间;流式细胞仪检测表面标志物;并检测细胞经成骨诱导后3、6、9d的ALP含量,于第9天采用Kaplow法染色观察细胞ALP染色情况。结果全骨髓培养法分离的原代细胞呈聚集样生长,而密度梯度离心法分离的原代细胞呈单个、散在生长。HE染色示两种方法分离培养的第2代细胞轮廓清晰,大小及形态均匀一致。全骨髓培养法原代细胞的传代时间(15.36±1.67)d;明显快于密度梯度离心法的(18.57±1.05)d,差异有统计学意义(P<0.01);第2、3代细胞的传代时间两种分离方法差异无统计学意义(P>0.05)。经流式细胞仪检测,两种方法培养的hBMSCs上阳性表面标志物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166含量和阴性表面标志物CD34含量比较差异无统计学意义(P>0.05),阴性表面标志物CD14、CD45含量差异有统计学意义(P<0.01)。两种方法分离的第2代细胞经成骨诱导后各时间点ALP含量比较差异无统计学意义(P>0.05);成骨诱导后第9天ALP染色程度基本一致。结论全骨髓培养法可分离出hBMSCs,其分离效果与密度梯度离心法相似。

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景:要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。目的:采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。方法:通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。结果与结论:全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。

全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞及向神经样细胞分化的研究

目的目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离方法,实验通过全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经样细胞,以寻找一种简便、实用的分离方法。方法取大鼠骨髓,全骨髓培养法结合差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增。倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,免疫组化染色鉴定细胞。用MTT法间接测定不同代数细胞活力。诱导分化,先用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24h,然后加入丁羟基茴香醚诱导(BHA)和二甲基亚砜(DMSO)诱导。观察诱导过程中细胞的形态变化,并用免疫组化染色法鉴定细胞。结果全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,免疫荧光染色示CD90、CD71、CD106表达阳性,CD45阴性。MTT法检测细胞活力示2、4、6代细胞于酶标仪490nm波长处吸光度值均高于第8、10代细胞。细胞经诱导后,细胞呈神经样细胞形态,并且神经元特异性表面标志β微管蛋白(β-Ⅲ-Tubulin)、巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性。结论采用全骨髓培养法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化为神经样细胞。

全骨髓贴壁培养兔骨髓间充质干细胞的初步研究

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复骨缺损的可能性。方法:选取2月龄约2.5 kg重健康新西兰兔8只,采用全骨髓贴壁培养法体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,通过倒置相差显微镜观察、MTT检测、细胞贴壁率检测观察细胞生物学特性。结果:全骨髓贴壁培养法培养出的原代骨髓间充质干细胞活力良好,细胞数量经传代后扩增,且细胞纯度提高,但细胞扩增速度较慢。结论:全骨髓贴壁培养法简便易行,能有效的在体外获得原代骨髓间充质干细胞。所提取的细胞活性良好、纯度较高,能用作组织工程种子细胞治疗骨缺损。

不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景:骨髓间充质干细胞常被用作骨组织工程的种子细胞和基因治疗的载体细胞,如何获得纯度较高活性较好的骨髓间充质干细胞是很多研究者关心的问题。目的:观察不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响。方法:分别用密度梯度离心法、全骨髓培养法和红细胞裂解液法提取兔骨髓间充质干细胞,48h后观察各组获得的细胞量,记录各组首次传代时间,相差显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪鉴定其CD44抗原表达。分别用DMEM-LG、MEM-HG和DMEM/F123种培养基培养第3代细胞和第7代老化细胞,MTT法和计数板计数法比较不同时间点3种培养基培养细胞的生长情况,相差显微镜观察老化细胞的形态变化。结果与结论:3种分离方法均能得到较均一的梭形或者多角形贴壁细胞,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。其中红细胞裂解液法获得的贴壁细胞的量较其他方法多,首次传代时间短(P<0.05)。用DMEM/F12培养的细胞活力更好,细胞生长更迅速,并且经过DMEM/F12培养一段时间后,部分静止期细胞开始分裂增殖。提示红细胞裂解液法能够提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,是一种方便、有效的提取方法;DMEM/F12更能够促进细胞的增殖,较适合于培养骨髓间充质干细胞。

大鼠骨髓间充质干细胞培养方法的比较及细胞鉴定

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)不同培养方法的差异。方法采用全骨髓法和密度梯度离心法,对SD大鼠股骨、胫骨骨髓进行分离、纯化和扩增,观察2种方法培养的第0～10代的细胞形态,测定每一代细胞的数量,用流式细胞仪检测第5代细胞CD29、CD34、CD44、CD45的表达率。结果 2种培养方法所获得的细胞形态均呈长梭形,呈特征性的漩涡状生长。全骨髓培养法细胞增殖较快。全骨髓培养法获得的细胞表面标志CD29、CD34、CD44、CD45的表达率分别为91.0%、4.3%、87.1%、0.1%;密度梯度离心法获得的细胞表面标志CD29、CD34、CD44、CD45的表达率分别为96.9%、3.6%、89.7%、0.0%。结论 2种方法培养的细胞均符合BMSCs的特性。全骨髓培养法更经济,操作简单易行,更容易获得大量的BMSCs。

全骨髓直接贴壁分离人骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景：体外分离培养骨髓间充质干细胞成为实验研究和临床应用的关键环节。目的：采用全骨髓培养法分离人骨髓间充质干细胞,建立一种简单、有效的分离培养骨髓间充质干细胞的方法。方法：通过全骨髓培养法分离培养人骨髓间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养。分别在特定诱导体系中诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪、成骨及软骨细胞分化。结果与结论：采用全骨髓培养分离法能获得90%以上纯度的骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;细胞倍增时间为（24.04±0.49）h;细胞周期分析表明：G0~G1期和S＋G2＋M期所占比例分别为71.63%和28.37%;诱导分化结果显示,人骨髓间充质干细胞能够向脂肪、骨和软骨细胞分化。说明全骨髓分离培养法是一种较好的分离人骨髓间充质干细胞的方法。

兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定和体外标记

目的:探讨分离、体外培养、鉴定及体外标记兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stemcells,MSCs)的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法:选择健康幼龄新西兰大耳白兔,于双侧髂后上嵴及胫骨上端内侧部行骨髓穿刺提取骨髓。采用全骨髓培养法(直接贴壁法)分离培养MSCs,对第2、3、4、5、6代MSCs应用MTT法测定生长曲线,分析MSCs的生长规律。对MSCs进行形态学观察,通过流式细胞术对CD34、CD44、CD45、CD105这4种MSCs表面抗原进行鉴定,证明所培养的细胞为MSCs。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU)体外标记兔MSCs,检测其标记阳性率。结果:全骨髓培养法培养的原代MSCs接种4天后可以被观察到,形态均匀成梭形,生长增殖迅速,符合MSCs生长的特性,7～8d MSCs融合接近80%,传代培养生长良好。MSCs生长曲线呈S型,由生长曲线分析可知,MSCs在培养第4～8d为高速生长期,MSCs在第3～5代生长最为旺盛。经流式细胞术鉴定,CD34(-)、CD45(-)、CD44(+)、CD105(+),证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU体外标记兔MSCs的阳性率达到85%～90%。结论:应用本实验方法,可以分离、纯化培养兔骨髓间充质干细胞且操作简便,效率高,经济实用。所培养的MSCs体外生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、可连续传代,可用于MSCs功能及应用的进一步研究。应用BrdU体外标记兔MSCs是安全可靠的。

大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定以及向神经干细胞分化的实验研究

目的:体外培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),研究其生物学特性,初步探索酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)诱导其向神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化的可行性。方法:全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察其形态特征,MTT法绘制生长曲线,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定细胞周期并鉴定细胞表面标志物。用80 ng/ml aFGF的无血清DMEM/F12培养液诱导大鼠BMSCs向NSCs分化,镜下观察细胞形态特征,免疫荧光染色方法检测神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)的表达。结果:大鼠BMSCs贴壁生长,呈梭形,多角形。第1、3、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。细胞周期显示94.34%BMSCs处于G0/G1期,有较强的分裂增殖能力。FCM检测CD29、CD54、CD90表达阳性,CD45表达阴性。诱导6 h后细胞的胞体收缩成椭圆形或球形并伸出细长突起,免疫荧光染色显示Nestin表达阳性,继续诱导发现双极和多极细胞增多,诱导6 d后相互连接成网状,成典型的神经元样细胞,NSE表达阳性。结论:全骨髓贴壁培养法能培养出高纯度的BMSCs,细胞生长稳定、增殖快、可多次传代,具有干细胞特性。经aFGF诱导后具有向NSCs分化的潜能,NSCs能进一步分化为神经元样细胞。

大鼠骨髓基质干细胞的改良培养方法及Hoechst体外标记研究

目的:改良大鼠骨髓基质干细胞全骨髓贴壁培养法,并进行Hoechst体外标记初步研究。方法:采用改良全骨髓贴壁法分离扩增大鼠骨髓基质干细胞,以MTT比色实验观察细胞生长状态并绘制生长曲线,行体外诱导向成骨细胞及脂肪细胞分化,以流式细胞术检测细胞表面抗原。以Hoechst体外标记大鼠骨髓基质干细胞,荧光显微镜下计数并观察Hoechest对细胞生长状态的影响。结果:改良全骨髓贴壁培养法能够在较短时间内获得纯化并具备高活性的骨髓基质干细胞,并成功诱导其分化为成骨细胞及脂肪细胞。流式细胞术检测显示细胞表面CD29、CD90、CD44均为阳性,CD45、CD34均为阴性。荧光显微镜观察Hoechst能够在体外成功标记骨髓基质干细胞,并对细胞的生长无明显影响。结论:经改良后的全骨髓贴壁培养法是获得纯化骨髓基质干细胞的一种更为简捷、高效、经济的途径,Hoechst可作为体外标记大鼠骨髓基质干细胞的标记物。

兔骨髓间充质干细胞体外BrdU标记最佳时间和标记浓度的筛选

背景：骨髓间充质干细胞是目前极具潜力的细胞和基因治疗的宿主细胞。体外标记是追踪其存活、＂归巢＂、生长、分化等一系列过程的前提。目的：探索5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记兔骨髓间充质干细胞的最佳时间和最佳浓度。方法：兔骨髓间充质干细胞取自纯种健康新西兰大耳白兔,通过形态学及流式细胞术鉴定分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。观察不同5-溴脱氧尿嘧啶核苷浓度标记及不同5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记时间对兔骨髓间充质干细胞的标记阳性率。结果与结论：流式细胞术检测培养的细胞为较纯的骨髓间充质干细胞,生长曲线呈S形。5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞率随标记时间延长以及标记物浓度增加而逐渐增高,40μmol/L及72h标记阳性率达85%~95%。结果提示,应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记骨髓间充质干细胞是安全可靠的,体外标记最佳时间和最佳浓度分别为72h和40μmol/L。

两种不同分离方法对羊骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景:近几年关于鼠、兔等小型动物骨髓间充质干细胞的研究较多,如何获得大型动物羊的骨髓间充质干细胞的报道还较少。目的:观察全骨髓培养法和密度梯度离心法对羊的骨髓间充质干细胞生物活性的影响。方法:取健康2月龄的阿勒泰大尾羊,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法提取羊骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察原代骨髓间充质干细胞的细胞形态及贴壁情况,记录两组细胞首次传代时间,流式细胞仪检测CD44抗原表达,MTT法测定细胞的生长曲线,VonKossa’s染色检测成骨诱导的分化潜能。结果与结论:两种分离方法均能得到较均一的梭形,三角形和多边形的BMSCs,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。全骨髓培养法较密度梯度离心法的细胞数量较多,传代时间略早。骨髓间充质干细胞诱导培养至第14～21天,两组的VoKossa染色均阳性。其中首次传代全骨髓贴壁法的传代细胞较密度梯度离心法的细胞贴壁较快,活力较好。提示全骨髓培养法是一种简单有效的提取方法。

猪髓核基质成分诱导骨髓间充质干细胞分化为脊索样细胞

背景:脊索细胞对椎间盘内严酷的内环境有良好的抵抗性,或许是治疗椎间盘退变性疾病合适的种子细胞来源。猪髓核终生含有大量脊索细胞,其基质内含有多种细胞因子可以促进骨髓间充质干细胞向脊索样细胞分化。目的:观察猪髓核基质对骨髓间充质干细胞分化的影响。方法:体外分离、培养、鉴定猪骨髓间充质干细胞;制备猪髓核粉末,并用配置好的DMEM完全培养基重悬粉末制备成含猪髓核组织的DMEM培养基,对骨髓间充质干细胞进行诱导3周,RT-PCR检测脊索细胞标记性基因鼠短尾突变体表型(T)、细胞角蛋白8及细胞角蛋白18的表达。该实验经复旦大学附属金山医院动物实验伦理委员会批准。结果与结论:(1)原代培养的骨髓间充质干细胞具有贴壁生长能力,在特定诱导条件下具有成骨、成脂分化能力,且能表达间充质干细胞表面标记物CD90、CD105;(2)在猪髓核基质成分诱导下骨髓间充质干细胞形态发生变化,表达鼠短尾突变体表型、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18;(3)结果显示,猪髓核基质成分能诱导骨髓间充质干细胞分化为具有脊索细胞表型的脊索样细胞,为椎间盘退行性疾病治疗提供可靠的种子细胞。

兔骨髓间充质干细胞体外BrdU标记的实验研究

目的探讨体外5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）标记兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs）的方法,探索BrdU体外标记兔MSCs的最佳时间和最佳浓度。方法通过形态学及流式细胞术鉴定全骨髓培养法分离培养的细胞为MSCs。MSCs经不同BrdU浓度标记及不同BrdU标记时间,免疫细胞化学法鉴定并评估。结果全骨髓培养法培养的MSCs经流式细胞术检测,证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU标记的阳性细胞率随标记时间延长以及标记物BrdU的浓度增加而逐渐增高,40μmol/L及72 h标记阳性率达85%~95%。结论应用BrdU体外标记MSCs是安全可靠的,兔MSCs体外BrdU标记最佳时间和最佳浓度分别为72 h和40μmol/L。

大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性

背景:如何能简便高效地获得均质性的骨髓间充质干细胞群是软骨组织工程研究的重点。目的:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,观察其生物学特性。方法:抽取30只SD大鼠股骨以及胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法体外分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪测定细胞表面标记物的表达,细胞计数法观察细胞生长增殖能力,MTT法检测细胞存活率。结果与结论:(1)刚分离培养的细胞呈圆形、椭圆形,部分细胞呈三角形,接种12-15 d后,细胞开始融合,传代后细胞增殖速度加快,传代2 h后细胞均匀分布在瓶底;(2)随着传代次数的增加,细胞增殖能力出现下降趋势,第1-5代细胞存活率均超过95%,显著高于第6代和第7代(P<0.05);(3)骨髓间充质干细胞表面CD34呈阴性表达,CD44呈阳性表达;(4)结果表明,采用全骨髓贴壁法可有效分离大鼠骨髓间充质干细胞,获得的细胞生长稳定,增殖能力强,可选用前5代细胞作为软骨组织工程的种子细胞。

两种分离培养小鼠骨髓来源内皮祖细胞方法的比较

目的比较密度梯度离心法及全骨髓培养法分离培养内皮祖细胞的差异。方法取4周雄性近交系C57BL/6J小鼠骨髓,分别使用密度梯度离心法及全骨髓培养法培养,观察细胞贴壁情况和细胞形态,并行DiI-acLDL及FITC-UEA-I双染、vWF、eNOS及细胞表面标志检测。结果密度梯度离心法培养细胞可形成典型铺路石样改变及形成血管样结构;而全骨髓培养法贴壁细胞形态多样,较多呈长梭形铺展生长,部分细胞呈类圆形及纺锤形。比较两种方法培养细胞摄取DiI-acLDL、结合FITC-UEA-I双阳性率以及vWF、eNOS及细胞表面标志表达阳性率,差别均有统计学意义(P<0.05)。应用密度梯度离心法,随着培养时间延长,表达CD34、CD133及FLk-1细胞逐渐增多(P<0.05)。结论密度梯度离心法及全骨髓培养法在EGM-2MV培养体系下均可培养出内皮祖细胞,但密度梯度离心法较全骨髓培养法培养的内皮祖细胞纯度高。

骨髓间充质干细胞传代扩增培养与干细胞干性的维持关系的研究

目的建立一种体外分离、培养骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的方法，研究BMMSCs传代扩增培养与干细胞干性的维持关系。方法采用全骨髓细胞贴壁培养法对大鼠BMMSCs进行分离、培养、传代。采用倒置显微镜观察各代细胞的形态，通过流式细胞术（FACS）观察各代BMMSCs干细胞干性，通过免疫荧光检测各代BMMSCS在肝硬化模型的表达。结果大鼠BMMSCs呈均一的成纤维细胞样。连续传代干细胞始终保持着旺盛的生长力及扩增力。FASC结果表明，CD29、CD44、CD90的表达率随着传代的进行逐渐增高，P5-P6时表达最高，之后其表达率逐渐下降，免疫荧光检测发现P5-P6代干细胞在大鼠肝硬化模型中表达最强。结论随着传代BMMSCs的干性逐渐增强，传代至P5-P6时干细胞干性最强，随着传代的继续其干性逐渐下降。