全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景:流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的:采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法:采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论:经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。

小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离扩增及鉴定

目的:探讨一种简单易行的的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)体外分离培养方法。方法:通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增小鼠BMSCs。观察原代及传代小鼠BMSCs形态变化,对第3代小鼠BMSCs表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106进行流式细胞仪检测。结果:小鼠BMSCs的原代接种培养24h后可见大量悬浮细胞,少许贴壁细胞,呈小圆形;72h后贴壁细胞逐渐增多,培养至第7天细胞伸展成长梭形,呈集落生长。BMSCs在培养的2～6d细胞增殖较慢,7～10d细胞增殖较快。传代后的小鼠BMSCs 24h基本全部贴壁,呈均匀性梭行细胞样生长。流式细胞仪检测结果显示:CD105、CD106表达阳性,表达率分别为92.2%、90.4%;CD34、CD45表达阴性,表达率分别为8.8%、13.1%。结论:采用全骨髓贴壁分离法操作简便,是培养小鼠BMSCs的理想方案。流式细胞术可以鉴定体外分离培养的小鼠BMSCs。

MSCs 2种分离培养方法及其培养液中的VEGF、SDF-1α浓度比较

目的通过2种分离培养方法所得骨髓间充质干细胞(MSCs)的生长特征和微环境中细胞因子的比较,提供一种可以快速、安全、高效地为临床和实验提供大量优质MSCs的方法。方法提取C57BL/c小鼠的骨髓,分别作密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养分离法分离培养MSCs,通过流式细胞仪检测细胞表面CD29+、CD31-、CD34-、CD45-表达水平,并比较各自所得细胞的生长曲线;ELISA检测培养液中的血管内皮生长因子(VEGF)、SDF-1α浓度并比较二者的差异。结果与密度梯度离心法比较,全骨髓贴壁分离法所得原代细胞有较快的生长速度,较短的生长周期;培养液中VEGF和SDF-1α浓度也稍高于密度梯度离心法。结论全骨髓贴壁培养法可以快速、方便、有效地为临床和实验提供大量MSCs,所得细胞的培养环境优于密度梯度离心法,减少了对细胞功能的损害。