八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因分子进化特征

对来自蓝藻、绿藻和高等植物中的pds基因用最大似然法进行了系统发育分析,来估算pds基因在进化过程中的正选择位点。通过位点模型和分支-位点模型分别对PDS不同位点和不同分支中的位点进行正选择作用的估算。结果发现,pds基因的适应性进化主要发生在系统发育树的不同分支上。在绿藻分支中,有7.9%位点受到正选择作用;在高等植物分支中,有6.1%位点受到正选择作用;在蓝藻分支中,有2.6%位点受到正选择作用。这些正选择位点的识别,可以为PDS活性研究提供重要的线索。

雨生红球藻八氢番茄红素脱氢酶pds基因上游序列的分离和分析

在某些蓝藻、绿藻和高等植物中,八氢番茄红素脱氢酶是β-胡萝卜素合成过程中的一个关键酶之一,应用巢式PCR方法从雨生红球藻中克隆了八氢番茄红素脱氢酶基因约1kb的5’上游序列。通过生物信息学方法进行序列分析,发现pds基因上游序列中包含了一些可能的顺式元件,如ABRE调控元件、C-repeat/DRE调控元件等。同时,构建了由pds-启动子控制报告基因的重组载体,并转化到雨生红球藻细胞中,进行了报告基因瞬间表达的检测。结果表明,克隆的pds启动子区域具有启动子活性,可以驱使报告基因进行瞬间表达。

白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶基因PDS3的克隆与序列分析

利用电子克隆技术,从数据库中找到与拟南芥高度同源的油菜EST序列,继而通过RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶(类胡萝卜素合成途径中的一个关键限速酶)基因PDS3的cDNA,命名为BrPDS3(GenBank登记号GQ200741)。cDNA序列全长1 940bp,其中包含114bp的5'前导序列和134bp的3'不翻译序列,编码区长度为1 692bp,编码63kD的蛋白。序列分析表明,BrPDS3蛋白与其他植物的PDS蛋白具有较高相似性;在系统进化树中,BrPDS3与甘蓝亲缘关系最近。根据全长cDNA序列设计引物,从白菜型油菜青油13号DNA中克隆得到BrPDS3基因的全长DNA,长度为3 911bp,ORF(开放阅读框)1 692bp,含有15个外显子和14个内含子。

八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素脱氢酶(Pds)是番茄红素合成的关键酶,本研究通过PCR法获取pds基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pMD1中,构建了含果实特异表达启动子的pds基因的植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明:番茄果实特异性表达pds的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105中,为下一步pds在番茄果实中特异表达奠定了基础。

三角褐指藻八氢番茄红素脱氢酶1-2基因启动子克隆和表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素合成的关键酶,在光合生物的类胡萝卜素代谢调控中发挥了重要的作用。本研究根据三角褐指藻基因组数据库,克隆三角褐指藻PDS1和PDS2基因启动子序列,采用启动子缺失技术研究启动子活性,利用Plant CARE预测三角褐指藻PDS1和PDS2启动子顺式作用元件,采用qRT-PCR技术检测三角褐指藻PDS1和PDS2基因在不同胁迫下的相对表达量。结果表明,三角褐指藻PDS1和PDS2基因启动子全长分别为2000 bp和920 bp,不同长度的5′端缺失后启动子均能驱动绿色荧光蛋白表达,具有较强启动子活性。Plant CARE分析结果表明,三角褐指藻PDS1和PDS2基因启动子中均含有与光照和植物激素响应有关的顺式作用元件。光照和植物激素胁迫处理结果表明,三角褐指藻PDS1基因受光合诱导因子(photosynthetic induction factor,PIF)的诱导表达,但在其他因子处理下表达均显著下降(P<0.05)或无显著性差异。三角褐指藻PDS2基因在PIF、红光、茉莉酸甲酯、乙酰水杨酸和脱落酸胁迫下均表达上调(P<0.05),在光合作用抑制剂二氯苯基二甲脲(dichlorophenyl dimethylurea,DCMU)、黄光和蓝光胁迫下显著下调(P<0.05)。三角褐指藻PDS2基因在不同处理下的基因表达和岩藻黄素含量呈显著的正相关关系(r=0.8551,P<0.01),说明PDS2基因可能是三角褐指藻岩藻黄素合成的关键基因。本研究揭示了三角褐指藻的PDS基因参与光系统和植物激素胁迫应答的新功能,为进一步研究岩藻黄素调控机制提供了一定的理论基础。

棉花八氢番茄红素脱氢酶GhPDS1基因的克隆与表达谱分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)在胡萝卜素生理代谢和病毒诱导外源基因沉默中起着非常重要的作用。本研究通过同源克隆方法,分析已报道植物八氢番茄红素脱氢酶氨基酸保守区,设计简并引物,扩增出编码棉花PDS基因cDNA中间片段。通过RACE技术成功地克隆了棉花PDS基因的全长cDNA,命名为GhPDS1(GenBank No.HQ441184)。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,该基因在花中表达量最高,其次为叶片。棉花PDS基因的成功克隆使得该基因可在病毒诱导的基因沉默研究中作为一个检测显示基因,它的沉默直接导致棉花叶片表现出斑驳、褪色等生物学特征,便于棉花中重要功能基因的深入研究。

黄秋葵八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与分析

该研究根据黄秋葵( Hibiscus esculentus L.)转录组测序获得的八氢番茄红素脱氢酶基因( HePDS )序列(GenBank登录号为MG372370)设计引物,克隆验证得到1条 HePDS 基因全长为2 020 bp cDNA,开放阅读框(ORF)包含1 686个碱基;预测其编码561个氨基酸,理论分子量为62.62 kD,等电点为8.155;编码的蛋白与海岛棉( Gossypium barbadense )、雷蒙德氏棉( Gossypium raimondii )、陆地棉( Gossypium hirsutum )同源蛋白的相似性均在93%以上,均含有1个保守的二核苷酸结合域和1个类胡萝卜素结合域,显示其高度的保守性。荧光定量PCR 分析表明, HePDS 基因在黄秋葵根、茎、叶、花和果荚中均有表达;叶发育过程以嫩叶中表达最高,果实发育中以花后2 d表达量最高。类胡萝卜素含量随着叶、果实发育逐渐升高,成熟叶的含量最高,果实以花后4 d含量最高,且 HePDS 基因的表达与类胡萝卜素含量存在密切的相关性。该研究结果为进一步探讨 HePDS 基因的功能和调控机制,以及采用VIGS和CRISPR/Cas9技术开展黄秋葵基因功能的反向遗传学研究奠定了基础。

八氢番茄红素脱氢酶基因超表达载体的构建及表达鉴定

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄中该酶的编码基因序列设计一对特异引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1 900 bp的全长cDNA片段。对这个全长片段构建了超表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体。采用农杆菌介导的方法转化番茄获得10株转基因植株,PCR检测表明外源基因已导入番茄基因组中。转基因番茄果实的番茄红素含量分析结果表明,转基因后代株系番茄红素平均含量比对照增加了1.4倍,PDS编码基因的超表达有效促进了番茄果实中番茄红素的合成和积累。

欧文氏菌AEBL002菌株八氢番茄红素脱氢酶基因保守序列的克隆与同源性分析

从农田土壤中分离筛选到一株产胡萝卜素菌 AEBL0 0 2 ,提取其基因组 DNA,根据报告的八氢番茄红素脱氢酶基因设计 PCR引物 ,对 AEBL0 0 2基因组 DNA进行 RCR扩增 .扩增产物为一条大小约为 80 0 bp的 DNA片段 ,在 Genbank中对其进行同源性检索 ,发现该片段与 Erwinia uredovora八氢番茄红素脱氢酶基因在 73 2个碱基中有 96.0 3 8%的一致性 .

普通烟草八氢番茄红素脱氢酶基因的原核表达及表达谱分析

基于NCBI数据库中本氏烟(Nicotiana benthamiana)的烟草八氢番茄红素脱氢酶PDS基因(ABE99707)的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以烟草栽培品种红花大金元叶片总RNA为模板,通过PCR方法获得了烟草NtPDS基因的cDNA片段。序列分析表明,该基因编码区为1749 bp,编码582个氨基酸,推测该蛋白等电点为7.53,理论分子量为65.04 kD。通过构建融合表达载体pET-32a-NtPDS,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃下经1 mmol/L IPTG诱导4 h表达后,产生了以可溶性蛋白形式存在的NtPDS融合蛋白,并通过Western blotting验证融合蛋白获得表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,该基因在烟草的叶片、花和茎中均有表达,在根中没有表达。该结果为进一步研究烟草八氢番茄红素脱氢酶NtPDS的活性和生物学功能奠定了基础。

巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)类胡萝卜素生物合成途径中的上游关键酶。本研究根据NCBI上已发布的巴氏杜氏藻mRNA序列(GenBank:Y14807),设计特异性引物,通过基因组步移法及半巢式PCR的方法,获得PDS编码区序列。在编码区序列获取过程中,发现5’端编码区有325 bp序列与NCBI上公布的cDNA序列有所不同,故采用了5’RACE技术进行验证,经过比对发现结果与本实验基因组步移所获得序列相匹配,推测NCBI公布mRNA序列的PDS与本实验获取的PDS可能为同工酶。然后根据获得的序列,再利用基因组步移PCR的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对其进行分析。实验获得的完整PDS基因全长12678 bp,其中编码区序列长度为8113 bp,编码区上游序列3010 bp,编码区下游序列1555 bp,编码区序列含有12个外显子和11个内含子。通过生物信息学分,发现PDS启动子中具有多种转录因子结合位点。

盐藻八氢番茄红素脱氢酶cDNA的分离及序列分析

采用5’和3’RACE技术和梯度PCR方法从盐藻中克隆了八氢番茄红素脱氢酶(Pds)全长cDNA,序列分析表明,该cDNA长2198bp,包含1个1752bp的开放阅读框(ORF),编码一段583氨基酸残基的多肽链。氨基酸序列的同源性分析表明,它与高等植物和蓝藻的八氢番茄红素脱氢酶序列一致性高达67%,而与细菌和酵母的序列同源性较差;在N端具有一段转运序列和辅助因子结合结构域,C端则有一胡萝卜素结合域。这些序列特征预示,盐藻Pds与其他绿藻、高等植物和蓝藻中的同源基因一样催化八氢番茄红素发生前2步脱氢反应,并且需要与另一个脱氢酶联合作用合成番茄红素。

茶树八氢番茄红素脱氢酶cDNA全长克隆与表达分析

八氢番茄红素脱氢酶是类胡萝卜素生物合成途径的关键酶之一。本实验采用3'/5'RACE和RTPCR技术成功扩增出茶树八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的3'端和5'端序列,序列拼接获得全长cDNA序列,命名为CsPDS,并将其登录至GenBank,登录号KF646537。经生物信息学分析,所得基因cDNA序列全长为2295 bp,开放阅读框(ORF)1749 bp,编码582个氨基酸,预测分子量约为64.86 kDa,理论等电点(PI)为6.77,属于亲水性蛋白。该基因编码的氨基酸序列与柿树PDS序列的同源性达到87%,多序列比对表明茶树PDS具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树、葡萄的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果显示,CsPDS在‘黄金芽’体内表达没有受抑制,表明‘黄金芽’黄色白化可能不是在CsPDS基因转录水平异常而引起。

八氢番茄红素脱氢酶抑制剂类除草剂的研究进展

植物类胡萝卜素在光合作用、激素合成和维生素合成方面有着重要作用。八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素生物合成途径的重要限速酶,仅在植物中存在。PDS失活能阻断类胡萝卜素生物合成,使得叶片白化,最终导致植物死亡。以PDS为靶标,研究开发了多种高效除草剂。这类除草剂属于非竞争性抑制PDS,并且对动物是安全的。一些植物因为PDS基因突变而产生了对PDS抑制剂类除草剂的抗性,就PDS的生物学功能、PDS抑制剂类除草剂和相关抗性植物研究进展进行总结。

八氢番茄红素脱氢酶的分子结构及其与达草灭相互作用分析

八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)是除草剂达草灭的靶点,作者对野生型和两种定点突变型PDS的二维和三维结构进行预测,并通过DOCK6.5进行PDS与达草灭的分子对接比较,利用Gromacs进行分子动力学模拟,使用Amber9中的mm_pbsa.pl分析能量分布及变化,使用LIGPLOT+软件进行氢键分析确认结合氨基酸位点.结果表明突变对二维和三维结构无影响,但是在达草灭存在的情况下,突变的PDS有更高的结合能以及更弱的结合稳定性,更难以与达草灭结合,找到突变PDS蛋白对达草灭具有抗性的分子证据.

辣椒CaDXS和CaPDS基因沉默的表型比较

【目的】沉默辣椒CaDXS和CaPDS基因,比较分析两者白化表型的差异,寻找新的辣椒沉默标记基因。【方法】利用双酶切克隆技术构建CaDXS和CaPDS基因的沉默载体;通过农杆菌介导转化侵染辣椒,观察辣椒的沉默表型;采用实时荧光定量PCR技术检测CaDXS和CaPDS基因的沉默效率。【结果】农杆菌浸润21 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现褪绿症状,沉默CaPDS基因的辣椒叶片出现白化。农杆菌浸润30 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现较为明显的白化;沉默CaPDS基因的辣椒叶片白化程度加剧,新叶近乎白化。与CaDXS基因相比,沉默CaPDS基因导致的辣椒白化表型更明显和高效。沉默组辣椒叶片中CaDXS和CaPDS基因的表达量均显著降低(P<0.05),沉默效率分别为86.80%和93.08%,表明辣椒CaDXS和CaPDS基因被成功沉默。【结论】CaDXS基因可以作为辣椒的沉默标记基因,但沉默CaPDS基因的辣椒白化表型出现更早且明显,因此,CaPDS基因比CaDXS基因更适合作为辣椒沉默标记基因。

超表达牛奶子EutPDS提高番茄果实番茄红素含量

【目的】牛奶子果实中富含番茄红素,八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是番茄红素生物合成上游的重要酶。特异性超表达牛奶子Eut PDS基因(Gen Bank登录号:GQ254067),以期提高番茄果实中的番茄红素含量。【方法】通过RT-PCR方法从牛奶子果实中分离EutPDS基因cDNA及基因组全长,Southern杂交分析基因的拷贝数,专用软件分析此基因及蛋白结构。采用番茄2A11启动子构建果实特异性超表达载体,转化根瘤农杆菌GV3101后,借助农杆菌介导的叶盘法转化至‘中蔬四号’番茄。半定量RT-PCR检测转基因植株果实EutPDS基因的表达,高效液相色谱仪、实时定量PCR分别用于分析转基因番茄果实主要类胡萝卜素组分含量和内源类胡萝卜素代谢相关基因表达的变化。【结果】从牛奶子中克隆的EutPDS基因长度为1 920 bp,含有1 749 bp ORF。其基因组序列无内含子,单拷贝。EutPDS编码1个582个氨基酸的蛋白,该蛋白与其他植物PDS有很高的同源性,具有典型的二核苷酸结合域、类胡萝卜素结合域。采用农杆菌介导方法转化番茄叶盘,PCR检测,潮霉素筛选,成功获得了2个EutPDS转基因番茄株系,其果实颜色较对照更红。半定量分析显示外源EutPDS基因在转基因番茄果实中超表达,实时定量PCR分析表明番茄红素生物合成上游2个内源基因Sl PSY和Sl ZDS受影响显著上调,同时1个下游基因Sl LCY-e的表达则显著下调,使得转基因番茄果实中番茄红素含量为野生型的2倍,但β-胡萝卜素含量无显著变化。【结论】在番茄果实中特异性超表达牛奶子EutPDS基因可有效促进番茄果实中番茄红素的合成和积累。

芥蓝八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2的克隆与表达分析

以白花芥蓝为材料,采用反转录PCR技术克隆得到2个八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2,GenBank登录号为KX426039和KX426040,其开放阅读框分别为1 692和1 698 bp,分别编码563和565个氨基酸。同源性及进化树构建结果表明PDS蛋白在进化过程中比较保守,芥蓝PDS基因与甘蓝、白菜、花椰菜等十字花科蔬菜亲缘关系较近。半定量PCR分析发现,BaPDS1和BaPDS2表达水平在芥蓝不同发育时期和组织器官间均存在显著差异。萌动种子期BaPDSs表达量较低,之后迅速上升;BaPDS1在成熟期器官间呈现组成型表达,BaPDS2在器官间表达差异较大,幼果中未检出;花器官中萼片的BaPDSs表达量显著低于其他组织,在开花过程中,雄蕊和雌蕊的BaPDS1表达水平出现上调。

广藿香八氢番茄红素脱氢酶PcPDS1基因克隆和序列分析

目的为阐明广藿香类胡萝卜素代谢途径,克隆了广藿香Pogostemon cablin八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因,并对其进行相关生物信息学分析。方法搜索本课题组建立的广藿香转录组数据库,获得PDS基因全长序列,并设计全长引物进行PCR验证;利用生物信息学软件对PDS基因进行生物信息学分析。结果本研究获得的广藿香PDS基因命名为PcPDS1(GenBank登录号为KC854409),该基因全长1 960个碱基,编码569个氨基酸。基于生物信息软件分析了PcPDS1基因编码蛋白的理化特性。系统进化树分析结果表明,PcPDS1基因与黄龙胆Gentiana lutea的PDS序列同源性最高,与烟草Nicotiana tabacum、番薯Ipomoea batatas次之,与自然进化关系保持一致。结论成功克隆、分析了广藿香PcPDS1基因。

植物八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因保守结构域模式与系统进化分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素生物合成过程中催化无色的八氢番茄红素形成有色的ζ-类胡萝卜素的关键酶。本文选取公开发表的PDS及通过在NCBI数据库中搜索得到的43条来自于不同物种的PDS的氨基酸序列进行分析。通过CDD在线软件预测每条氨基酸序列保守结构域,结果表明,所选取序列均包含一个NAD(P)-binding domain保守结构域,其长度为51个氨基酸,不同物种保守结构域中氨基酸的突变集中在8个不同的位置上;利用MEGA等软件进行多序列比对后构建系统进化树,可以看到不同物种的PDS蛋白清晰地分类到各自的类群内,和传统的分类学结果一致,表明所有不同分支的PDS蛋白都是单系同源,并不存在物种间的水平基因转移。