八聚精氨酸修饰的载ASODN脂质体的构建及体外评价

用硬脂酰八聚精氨酸(R8)对普通脂质体进行修饰,以期获得高效低毒的反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)载体.修饰后的脂质体(R8-Lip)与反义寡核苷酸孵育,用琼脂糖凝胶电泳法考察复合物的形成情况;在肝癌细胞(HepG2)、肺癌细胞(A549)和口腔上皮癌细胞(KB)中,用MTT法评估R8-Lip的细胞毒性;同时考察在这三种细胞株中,R8的浓度与摄取效率的关系.当R8-Lip/ASODN复合物中正负电荷比(+/-)超过4∶1时,ASODN已与R8-Lip完全结合成带正电的复合物;当R8-Lip中R8的质量浓度小于10μg/mL时,细胞存活率大于75%;R8-Lip对ASODN细胞摄取的促进作用与R8的浓度有关,当R8的质量浓度由0.3μg/mL增加到9.6μg/mL(+/-由1∶2增加到16∶1),细胞内荧光强度逐渐增加;当R8-Lip/ASODN复合物中+/-=16∶1时,R8对ASODN摄取的促进作用强于市售的转染试剂Lipfectamine2000.因此,R8-Lip作为ASODN的载体,具备了高效低毒的优势,值得进一步深入研究.

叶酸与八聚精氨酸双修饰脂质体的制备及其功效观察

目的制备叶酸与穿膜肽八聚精氨酸(R8)双修饰的脂质体,并观察其功效。方法采用注入法制备叶酸与穿膜肽R8双修饰的脂质体(FA-R8-LPs),采用激光粒度分析仪对脂质体粒径和电位进行测定,采用琼脂糖凝胶电泳方法考察脂质体与VEGF siRNA的结合度,分别采用流式细胞计数法、激光共聚焦显微镜观察及Western blotting法观察载有VEGF siRNA脂质体对口腔癌KB细胞的抗肿瘤效果。结果叶酸与穿膜肽R8双修饰的脂质体粒径为(112.5±3.7)nm,电位为(3.23±0.88)m V。FA-R8-LPs已基本完全与VEGF siRNA结合(FA-R8-LPssiRNA)。FA-R8-LPs-siRNA对KB细胞的抑制率为44.5%,平均荧光强度值是未修饰脂质体的5倍左右。FA-R8-LPs与未修饰的脂质体相比明显提高了转染效率。结论成功制备了叶酸与穿膜肽R8双修饰的脂质体,该脂质体能增强VEGF siRNA的抗肿瘤效果。

LHRHa与八聚精氨酸共修饰载氟尿嘧啶靶向脂质体的构建及其抗前列腺癌作用

目的构建促黄体激素释放激素类似物(LHRHa)与八聚精氨酸(R8)共修饰载氟尿嘧啶(5-FU)脂质体(LHRHa/R8-LP-5-FU),对其前列腺癌靶向性以及治疗效果进行初步研究。方法采用薄膜分散法制备LHRHa/R8-LP-5-FU,考察其形态、粒径、电位,并通过PC-3前列腺癌细胞定性和定量摄取实验考察其前列腺癌细胞靶向性。采用噻唑蓝(MTT)实验以及肿瘤球实验考察LHRHa/R8-LP-5-FU对PC-3细胞增殖抑制率。结果所制备LHRHa/R8-LP-5-FU粒径为(115.0±15.2)nm,电位为(11.00±2.15)m V,5-FU的包封率(84.5±5.1)%。体外细胞摄取实验表明,PC-3细胞对LHRHa/R8-LP摄取效率分别是R8修饰脂质体(R8-LP)和LHRHa修饰脂质体(LHRHa-LP)2.8和3.2倍(P<0.01)。细胞毒性实验结果显示,以0.9%氯化钠溶液为对照,LP-5-FU、R8-LP-5-FU、LHRHa-LP-5-FU和LHRHa/R8-LP-5-FU对PC-3细胞的增殖抑制率分别为(26.4±4.5)%,(39.5±4.2)%,(48.6±3.5)%和(82.5±4.3)%(P<0.01)。LHRHa/R8-LP-5-FU对肿瘤球的生长抑制作用明显高于其他脂质体。细胞毒性实验结果与细胞摄取实验结果一致。结论 LHRHa与细胞穿膜肽共修饰载5-FU脂质体具有良好的前列腺肿瘤细胞靶向性和抗肿瘤作用,是一种潜在的治疗前列腺癌的高效给药系统。

八聚精氨酸的Fmoc固相合成及其提高载体穿透细胞膜能力的研究

采用Fmoc固相合成法制备八聚精氨酸,并将其用于提高载药体系穿透细胞膜的能力。研究考察了王树脂取代度、搅拌方式以及树脂粒度对于酯化效率的影响,并进一步考察八聚精氨酸修饰对体系穿透细胞膜能力的影响。结果表明,氨基酸与王树脂的酯化效率随王树脂取代度的减小而增加;在其他条件相同的情况下,机械搅拌的酯化效率较恒温振荡方式更高;王树脂粒度越小,树脂表面裸露羟基相对越多,反应物扩散路径越短,越有利于酯化反应进行,酯化效率越高。经飞行质谱分析,证实反应产物中含有八聚精氨酸。红外分析进一步对产物结构进行了确证。细胞摄取实验证明,经八聚精氨酸修饰后,体系穿透细胞膜的能力显著提高。

八聚精氨酸修饰的载紫杉醇脂质体的制备工艺研究

目的研究八聚精氨酸(R8)修饰的载紫杉醇脂质体的制备工艺。方法采用有机相反应法,将R8修饰到脂质体表面,并以薄膜分散-探头超声法制备载紫杉醇脂质体,以细胞摄取、粒径、PDI、包封率为主要指标对磷脂/胆固醇、药脂比、水化液种类、R8密度、DSPE-PEG2000密度进行筛选,进一步优化处方。结果最优处方为磷脂-胆固醇2∶1、药脂比1∶40、水化液为PBS(pH6.5)、R8密度5%、DSPE-PEG2000密度3%,所制脂质体的粒径为156±2 nm,PDI=0.25,包封率为80.87%±8.9%。结论成功制备了八聚精氨酸(R8)修饰的载紫杉醇脂质体。

转铁蛋白与R8共修饰脂质体的制备及其肝癌靶向性研究

目的制备转铁蛋白(transferrin,TF)和八聚精氨酸(R8)共修饰脂质体(TF/R8-LP),对其理化性质进行表征,研究脂质体对肿瘤细胞的靶向性。方法采用薄膜分散法制备TF/R8-LP,研究脂质体的粒径,电位和血清稳定性。细胞摄取实验研究肝癌HepG2细胞对TF/RS-LP的摄取效率。构建裸鼠肝癌异位瘤模型,研究脂质体的体内靶向性。结果 TF/R8-LP的粒径在(108.5±12.6)nm,电位为(24.15±4.78)mV。TF/R8-LP在50%血清中具有良好的稳定性。细胞摄取实验结果显示:TF/R8-LP在4 h摄取效率是2 h的1.85倍,差异具有统计学意义(P<0.05);肝癌HepG2细胞在与脂质体共同孵育4 h后对TF/R8-LP的摄取效率分别是RS-LP、TF-LP和LP的2.4倍、2.8倍和3.9倍,差异均有统计学意义(P<0.01);近红外活体成像实验结果显示:TF/R8-LP组在肿瘤组织荧光明显强于其他组。结论转铁蛋白和八聚精氨酸共修饰脂质体具有良好的肝癌细胞亲和力,是一种潜在高效的肝癌靶向给药系统。

细胞膜穿透肽促进脂质体包载的siRNA细胞内转运、定位及其功能

目的研究细胞膜穿透性寡肽———八聚精氨酸(R8)输送包载siRNA的脂质体进入细胞能力的促进作用。方法将合成的R8与PEG-PE形成偶联物并定向定量地插入包载siRNA脂质体的外层膜上制成R8-liposom alsiRNA。荧光分光光度计测定脂质体中R8的含量,荧光倒置显微镜观察R8修饰的脂质体与常用转染试剂lipofectam ine 2000携带siRNA对小细胞肺癌NC I-H446的转染效果,MTT法检测R8-liposom al siRNA对NC I-H446细胞的生长抑制作用。结果R8未修饰的脂质体不能穿过细胞膜,而R8修饰的脂质体则能迅速进入细胞内,随着作用时间的延长逐渐定位在细胞浆和细胞核。R8修饰的脂质体介导hdm2-siRNA转染肿瘤细胞的效率和对肿瘤细胞的生长抑制作用明显强于lipofectam ine 2000。结论R8修饰的脂质体可以有效输送siRNA进入细胞并增强其生物学功能。

多肽修饰的还原敏感型靶向光敏剂的合成及生物活性评价

采用穿膜肽(八聚精氨酸)作为连接基团,双硫键为敏感化学键,叶酸作为靶向基团,修饰光敏剂替莫卟吩(m-THPC),制备了一种多肽修饰的还原敏感型靶向光敏剂1,其结构经核磁共振氢谱(1HNMR)和基质辅助激光离子化飞行时间型质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行表征.研究表明,八聚精氨酸的引入,可显著改善m-THPC的溶解度和提高肿瘤细胞的靶向性;在谷光甘肽(GSH)作用下,光敏剂1可释放出m-THPC,6h时的释放率大于80%.细胞毒性实验表明,光敏剂1在浓度为15μmol/L时,HeLa细胞的存活率可降至36.1%,细胞毒性大于叶酸-PEG-羧酸卟吩(光敏剂7).

细胞穿膜肽修饰的缩宫素脂质体的制备及经鼻入脑的靶向性研究

以逆向蒸发法制备脂质体(liposomes,LPs)包载水溶性多肽药物缩宫素(oxytocin,OT)以制备缩宫素脂质体(OT@LPs),并以阳离子型细胞膜穿透性寡肽—八聚精氨酸(arginine octamer,R8)进行表面修饰得细胞穿膜肽R8修饰的缩宫素脂质体(OT@LPs-R8)以赋予脂质体黏膜黏附性,并初步评价其鼻腔给药后脑内递药特性。结果表明,OT@LPs-R8形态圆整,粒径分布在110.2±7.3 nm,表面电位高达+18 mV,载药量为(62.17±1.88)%,包封率为(5.85±0.72)%,在鼻黏液中稳定,且对鼻黏膜无刺激性,鼻腔给药后可显著延长滞留性,增强脑内分布。动物实验符合复旦大学实验动物科学部关于动物实验伦理的规定,并在通过复旦大学动物伦理委员会审查后进行。本研究表明,鼻腔给予OT@LPs-R8能够促进缩宫素由鼻直接入脑,有望成为向脑内递送缩宫素的新型载体。