脆弱拟杆菌六型分泌系统对肠道屏障的影响及机制

【目的】探讨脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)中六型蛋白分泌系统(T6SS)对肠道屏障的影响及作用机制。【方法】采用自杀载体构建B.fragilis T6SS缺陷株。建立葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎小鼠模型,并分别补充PBS,B.fragilis WT和B.fragilisΔT6SS,随后比较三组小鼠疾病特征、肠道屏障完整性的差异。利用荧光定量PCR和免疫组化检测小鼠紧密连接蛋白的表达。采用非靶向代谢组学比较各组小鼠肠道差异代谢物。【结果】T6SS缺失不影响B.fragilis的生物活性。与PBS对照组相比,B.fragilis WT明显改善小鼠的体重丢失、结肠长度等疾病指标,表现出对DSS诱导的肠炎的保护性,而B.fragilisΔT6SS随着T6SS的敲除丧失了对DSS诱导的肠炎的保护性。小鼠血清中异硫氰酸荧光素葡聚糖含量和肠道病理切片均表明B.fragilis T6SS能改善小鼠肠道屏障的完整性。荧光定量PCR和免疫组化均表明B.fragilis T6SS影响肠道紧密连接蛋白的表达。非靶向代谢组学分析表明,与B.fragilisΔT6SS组相比,B.fragilis WT组显著上调96个肠道差异代谢产物,其中多个代谢产物富集到胆碱能突触代谢和甘油磷脂代谢相关通路。【结论】拟杆菌T6SS改变肠道代谢组并提高肠道细胞紧密连接蛋白的表达,改善肠道屏障的通透性,参与到拟杆菌对肠道屏障的保护性。

细菌六型分泌系统的研究进展

六型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)作为一种广泛存在于革兰氏阴性细菌中的可收缩纳米装置,通过将有毒物质,即效应因子(effector)注射于真核或原核细胞体内,杀死真核捕食者或原核竞争对手.近年来,T6SS基因的多样性、纳米装置的组装和效应因子的致病机制等都获得了广泛关注,取得了重大的突破.本综述基于T6SS的基因组成、组件装配、效应因子种类和调节机制等,分析总结T6SS基因组成的多样性,不同元件组装机制和对应的结构基础,效应因子种类和致病机理,以及T6SS复杂的调控网络等方面的研究进展和未解决的问题,以期为T6SS的研究提供参考.

从效应蛋白视角看革兰氏阴性细菌Ⅵ型蛋白分泌系统底物转运机理

蛋白质分泌系统是细菌与外界交流的重要工具。革兰氏阴性细菌的Ⅵ型蛋白分泌系统(T6SS)可以转运分泌蛋白至细菌和真核细胞内,在菌间竞争中发挥重要作用,是细菌的一种重要的生存适应性武器。分泌蛋白主要包括起到运载作用的结构蛋白和有细胞毒性的效应蛋白这两类。本文主要从效应蛋白的视角讨论T6SS如何识别并转运效应蛋白的作用机理,回顾了以VgrG和PAAR为端部载体蛋白的转运途径、依赖端部运输的效应蛋白、T6SS伴侣蛋白等重要发现的背景和过程,并综述了T6SS分泌途径的新进展。

铜绿假单胞菌phzR对生物被膜基因转录及细胞运动性能的影响

为预测高产吩嗪类物质铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)工程菌株PA2019NES在农用开发时的生物安全性,本文采用实时荧光定量PCR技术,研究多拷贝phzR基因的PA2019NES与PA2016NX1在生物被膜状态(被膜态)、浮游状态(浮游态)的生物被膜、群体感应系统、六型分泌系统共9个基因转录量差异,结果显示:在浮游态下,多拷贝phzR基因上调vgrG、algD基因的mRNA转录量(P<0.05),下调pilA基因mRNA合成(P<0.05),但其他6个基因的转录量无显著差异(P>0.05);在被膜态下,仅提高rhlI基因的mRNA表达量(P<0.05),而fimX和wspR基因的mRNA合成受到抑制(P<0.05),但其他6个基因的转录量无显著影响(P>0.05);经24 h培养后,PA2016NX1和PA2019NES的蹭行运动无显著差异(P>0.05),但游泳运动后者强于前者(P<0.05),集群运动后者弱于前者(P<0.05)。此结果证明PA2019NES的条件致病性能可能不低于PA2016NX1,在农用开发该菌株时应杜绝活菌向环境扩散。

铜绿假单胞菌PA14 H3-T6SS的调控功能研究

【目的】研究模式病原细菌铜绿假单胞菌PA14(Pseudomonas aeruginosa PA14)第三套六型分泌系统(H3-T6SS)的调控机制和在环境适应等方面的功能,为该菌致病机制研究和治疗方案开发奠定基础。【方法】以铜绿假单胞菌PA14为研究对象,利用凝胶迁移阻滞试验(EMSA)验证σs因子(RpoS)与H3-T6SS启动子区的结合能力;构建rpoS敲除菌株(ΔrpoS)及回补菌株(rpoS),用启动子酶活试验研究RpoS对H3-T6SS表达的调控作用;构建H3-T6SS关键组分clpV3敲除菌株(ΔclpV3)及回补菌株(clpV3),测定其在酸、渗透压等不同胁迫下的细胞存活率;检测H3-T6SS对铜绿假单胞菌PA14生物膜形成和运动能力的影响。【结果】RpoS蛋白可以直接结合H3-T6SS启动子区;成功构建了铜绿假单胞菌PA14的rpoS和clpV3敲除菌株及回补菌株,RpoS正调控H3-T6SS的表达,H3-T6SS有助于细菌抵抗酸胁迫,但对渗透压胁迫响应不明显;H3-T6SS可显著增强细菌的生物膜形成和运动能力。【结论】铜绿假单胞菌PA14的H3-T6SS受调控因子RpoS的正调控,在增强细菌抗酸胁迫、生物膜形成和运动能力等方面有重要作用。

绿脓杆菌特有的Tsi2三维结构——一种全新卷曲螺旋构象的类抗毒素蛋白

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)利用六型分泌系统(T6SS)向其他竞争性细菌分泌毒素效应分子Tse2,这是一种新发现的绿脓杆菌获得生存优势的分子机制.为了避免同类间的误杀,绿脓杆菌合成一种特异结合Tse2的抑制蛋白Tsi2来保护自己.序列分析显示,Tsi2是绿脓杆菌特有的一种新型类抗毒素蛋白.我们利用SAD方法成功地解析了Tsi2 1.8魡分辨率的晶体结构.Tsi2的三维结构采用一种规则的卷曲螺旋的结构特征,这是抗毒素分子中的一种全新的折叠方式,不同于经典的抗毒素分子在没有结合毒素分子状态下采用无规则构象的结构特征;二聚体是Tsi2的功能单位,二聚体内两个Tsi2单体通过广阔的疏水相互作用紧密结合,形成"夹子"状独特的二聚体组装方式;位于二聚体界面上的两个凹槽分别结合对称分子的两段螺旋,提供了Tsi2与Tse2结合可能的分子部位.该研究工作结果对于认识Tsi2抗毒素蛋白的分子本质,揭示其发挥抗毒素活性的结构基础,并为进一步开展Tse2-Tsi2复合物的结构与功能研究奠定了坚实的基础.

禽致病性大肠杆菌clpV2基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究六型分泌系统2(type VI secretion system 2,T6SS2)clpV2基因对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)TW-XM菌株生物学特性的影响。本研究利用Red同源重组构建clpV2基因缺失株,将clpV2基因克隆到表达载体pBR322中,成功构建回补株。对突变株的部分生物学特性进行分析。结果显示:各突变株均能稳定遗传,且clpV2基因的缺失不影响TW-XM菌株的生长速度以及对多种抗生素的敏感性,但会导致其运动能力和生物被膜形成能力显著下降。综上表明,clpV2基因的缺失会影响TW-XM菌株的部分生物学特性,为进一步研究clpV2基因的功能和APEC的致病机制奠定基础。

霍乱弧菌新发菌株中vipA,vipB和clpV对T6SS转录调控

【目的】探索霍乱弧菌新发菌株H1的六型分泌系统(T6SS)存在的转录调控机制。【方法】本研究以转录组测序为基础,分析H1株分别由于vipA敲除(H1ΔvipA),vipB敲除(H1ΔvipB)和clpV敲除(H1ΔclpV)时T6SS基因簇的转录水平,并对其差异基因进行了基因本体论(GO)富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集。【结果】发现H1ΔvipA有22个差异基因(FDR<0.01,|log_(2)FC|≥1),其中有18个属于T6SS基因簇;并且除vipA外,其转录水平均呈上升趋势。结合GO富集和KEGG富集结果,发现vipA的缺失会引起与霍乱弧菌群体感应相关基因(hapR)的转录水平显著降低。【结论】我们得出结论 vipA基因在霍乱弧菌H1菌中是一个具有多重功能的基因,一是编码T6SS鞘结构蛋白,二是参与T6SS调控;推测hapR可能参与H1株中vipA对T6SS基因簇的转录调控。

霍乱弧菌密度感应系统研究进展

密度感应(Quorum sensing,QS)系统在细菌中普遍存在,细菌细胞通过识别和密度依赖性应答其自身或周围环境中其他菌细胞分泌的一种或多种信号分子来影响一系列基因的转录表达,从而参与细菌多种生理功能的调节。革兰阴性菌的密度感应现象最早发现于海洋弧菌中,本文主要综述了烈性肠道传染病病原体-霍乱弧菌中密度感应系统的研究进展,包括系统组成、信号传递过程、调节的生理功能及与其他全局性调控因子的相互作用。