基于ICP-MS技术的六神曲中无机元素分析及其风险评估

对六神曲中无机元素进行分析并结合风险评估,为发酵类中药中有益元素的揭示、有害元素限量标准的制定提供依据。基于电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术,对不同来源六神曲中无机元素进行含量测定,结合多元统计分析,对无机元素的特征进行表征,并对其进行初步风险评估。结果表明:六神曲中无机元素整体趋势一致,对比相关标准产六神曲生品发现,Zn、Ba、Cu为主要差异元素;按部颁标准产六神曲生品与麸炒品差异明显,Zn、Tl、Cu为特征差异元素;Cu、Cr、As为按《浙江省中药炮制规范》产六神曲生品与炒焦品中主要差异元素。风险评估结果提示,六神曲中有害元素的风险较低。方法稳定可靠,不同制法、不同炮制品六神曲中元素分布特征呈现出一定的规律性与差异性,其中重金属及有害元素的风险基本可控。研究结果可为六神曲质量控制体系的完善及安全性评价提供参考。

不同发酵工艺对浙产六神曲中5种成分含量变化的影响

目的建立同时测定浙产六神曲中苦杏仁苷、香草酸、芦丁、阿魏酸、槲皮素的高效液相色谱法,并考察不同发酵条件对浙产六神曲中5个成分含量变化的影响。方法对同一批次六神曲样品,通过设置不同的发酵条件(温度为25℃、30℃、35℃,相对湿度为60%、70%、80%、90%)进行发酵并分别取样。色谱柱为Chrom Core AR C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);以乙腈为流动相A,0.08%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱;流速为1.0 ml/min,柱温为30℃,检测波长220 nm。分析苦杏仁苷、香草酸、芦丁、阿魏酸、槲皮素5种成分的变化。结果苦杏仁苷、香草酸、芦丁、阿魏酸、槲皮素在选定质量浓度范围内线性关系、重复性、稳定性良好,平均加样回收率均达到要求。浙产六神曲最佳发酵工艺参数为温度30℃,相对湿度80%,发酵时间为3 d。结论本研究建立的方法操作简便、结果准确、重复性及稳定性均较好,可用于浙产六神曲的质量控制。浙产六神曲最佳发酵工艺参数为温度30℃,相对湿度80%,发酵时间为3 d。

高效液相荧光色谱法同时测定六神曲中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A

目的建立一种用免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生-高效液相色谱同时检测六神曲中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法。方法样品采用60%乙腈超声提取,免疫亲和柱净化,采用XBridge^(®)Phenyl苯基色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈和0.1%磷酸溶液为流动相,梯度洗脱,光化学衍生仪衍生,通过切换荧光波长检测。结果黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A标准曲线的线性范围分别为0.006~0.108、0.500~2.500和0.202~1.009 ng,6种毒素的线性关系在0.9994以上,检出限分别为1.2、100.0和40.3 ng/ml,平均加标回收率为73.2%~92.3%,相对偏差为2.1%~5.4%。结论该方法具有专属性强、操作方便等特点,能够有效用于六神曲中3种毒素的同时检测和安全质量控制。

中药六神曲发酵研究现状分析

中药六神曲具有健脾和胃、消食调中的功效,广泛应用于治疗脾胃虚弱和儿童食积。然而,传统的六神曲发酵方式存在一定的隐患。本文对六神曲发酵工艺、化学成分、酶活力、微生物群落变化及药理作用等研究进行了综述和分析,旨在为构建科学合理的质控方法提供参考。

固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定六神曲中4种烷基间苯二酚

建立固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定六神曲中5-十五烷基间苯二酚(AR-15)、5-十七烷基间苯二酚(AR-17)、5-十九烷基间苯二酚(AR-19)和5-二十一烷基间苯二酚(AR-21)4种烷基间苯二酚含量.分析采用Brownless Spp C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.7μm),流动相:A相为5 mmol/L乙酸铵溶液,B相为甲酸∶乙腈溶液(体积比为1∶1000),采用梯度洗脱方式,体积流速为0.5 mL/min.柱温为35℃,使用电喷雾离子源,负离子扫描,多反应监测模式.结合主成分分析与正交偏最小二乘法判别分析,寻找影响六神曲炮制前后质量的主要化学成分.结果表明,4种成分在各自范围内线性关系良好(r>0.9926),平均加样回收率在99.36%~101.36%之间,相对标准偏差(RSD)为0.85%~2.10%.通过化学模式识别分析发现造成主要差异的质量差异物是AR-21.方法简便可行,稳定可靠,可用于炮制不同六神曲的质量控制.

六神曲发酵过程挥发性风味成分的变化及中药组分缺失对其风味的影响

六神曲是自然发酵的中药曲剂,气味是监控六神曲发酵过程和评判质量的重要指标。该实验采用顶空固相微萃取-气质联用(HS-SPME-GC-MS)技术分析六神曲的挥发性风味成分,探究发酵过程挥发性风味物质的变化规律及中药组分缺失对其挥发性风味成分的影响。结果表明,在六神曲发酵过程中共检测出33种挥发性风味物质,其中2种酸类、6种醇类、7种酯类、3种醛类、11种烃类、1种酮类和3种其他类。六神曲在发酵0 h时挥发性风味物质以苯甲醛为主,含量为2157.43μg/mL。发酵过程中,苯甲醛含量迅速下降,72 h时含量降至116.15μg/mL,而苯甲醇、醋酸和苯乙酸甲酯等物质的含量明显上升,发酵结束时含量分别为703.95μg/mL、252.97μg/mL和143.12μg/mL。当中药组分缺失青蒿、辣蓼、苍耳草和苦杏仁中的任何一种,六神曲的挥发性风味物质发生极大变化,发酵过程中苯甲醛含量下降速度均减缓,而苯甲醇、醋酸和苯乙酸甲酯含量的增长速度亦降低;其中,原料缺少苦杏仁时的苯甲醛初始含量仅为101.73μg/mL,苦杏仁是苯甲醛的产生的主要因素。

六神曲多糖提取工艺优化及其抗溃疡性结肠炎作用研究

目的优化六神曲多糖提取工艺,并探讨其抗溃疡性结肠炎作用。方法以乙醇体积分数、醇提时间、液料比、水提时间为影响因素,多糖得率为评价指标,Box-Behnken响应面法优化提取工艺。采用2%葡聚糖硫酸钠(DSS)制备溃疡性结肠炎小鼠模型,检测体质量、粪便性状、粪便隐血情况,计算疾病活动指数(DAI),并结合结肠长度、结肠组织病理变化及脾脏CD4^(+)、CD8^(+)、Treg细胞比例考察多糖的肠道保护作用。结果最佳条件为乙醇体积分数78%,醇提时间2 h,液料比44∶1,水提时间2 h,多糖得率为18.457%。与模型组比较,六神曲多糖组小鼠体质量增加(P<0.01),DAI评分及CD4^(+)/CD8^(+)、CD4^(+)Foxp3^(+)Treg升高(P<0.01),结肠长度增长(P<0.01),结肠黏膜受损较轻,腺体排列基本规则,杯状细胞较多,炎症细胞浸润较少。结论该方法稳定可靠,可用于提取抗溃疡性结肠炎作用较强的六神曲多糖。

麸炒六神曲炮制工艺及质量标准研究

目的优选麸炒六神曲的炮制工艺并制定其质量标准。方法以颜色、气味为评价指标,浸出物为参考,通过炒制温度、炒制时间、麸皮加入量为考察因素,通过单因素试验优选麸炒六神曲炮制方法。通过对山西省内3家企业生产的15批生六神曲进行炮制,对15批麸炒六神曲的性状、显微鉴别、水分、灰分、酸不溶灰分、浸出物进行检测,通过对测定结果进行研究,制定相应的质量标准。结果麸炒六神曲的最佳炮制工艺为麸炒温度为130℃、炒制时间为12 min、麸皮用量为10%,经过上述炮制工艺得到的麸炒六神曲性状表面浅棕色至黄棕色、质坚脆、有麸香气,浸出物为22.26%。建立了麸炒六神曲的质量标准,性状表面棕黄色,质坚脆,有麦麸香气;易断,断面不平整,可见褐色残渣及发酵后的空隙。显微鉴别为麦麸的果皮表皮细胞紧密排列呈不规则片状;淀粉粒呈球形,层纹明显;苦杏仁和赤小豆的石细胞黄色或白色,胞腔黑色;赤小豆的种皮栅状细胞胞腔含淡红棕色物,光辉带明显。水分不得过10.0%;灰分不得过5.0%;酸不溶灰分不得过2.0%;浸出物不得少于17%。结论成功建立了麸炒六神曲的炮制工艺及质量标准,可为麸炒六神曲饮片生产及质量控制提供参考。

LC-MS法结合化学计量学法探讨发酵时间对六神曲中化学成分的影响

目的采用LC-MS法结合化学计量学分析法探究不同发酵时间六神曲中葫芦巴碱、没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、隐绿原酸、苦杏仁苷、香草酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、紫云英苷、槲皮素、槲皮苷、异绿原酸B、木犀草素、芹菜素的含量,并筛选差异性标志物。方法该药物的分析采用Hypersil GOLD C_(18)色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.9μm);流动相乙腈-0.1%甲酸,梯度洗脱;体积流量0.3 mL/min;柱温30℃。采用主成分分析(PCA)对六神曲进行分类和评价,再借助正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)法筛选出差异性标志物,并通过聚类热图进行区分。结果发酵过程中,葫芦巴碱、原儿茶醛、苦杏仁苷、芦丁、金丝桃苷、东莨菪内酯、紫云英苷质量分数呈下降趋势,没食子酸、原儿茶酸、香草酸、木犀草素、芹菜素质量分数呈上升趋势,隐绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素、槲皮苷、异绿原酸B质量分数存在波动;PCA结果显示,不同发酵时间六神曲可聚类为4个发酵阶段;OPLS-DA结果表明,原儿茶酸、苦杏仁苷、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、异绿原酸B为差异性标志物;以18种已知化学成分、6个差异性标志物含量为指标,分别进行聚类热图分析,聚类结果一致。结论该方法稳定可靠,可用于区分不同发酵时间六神曲。

“炒六神曲”质量标准研究

目的建立科学合理的“炒六神曲”质量控制标准。方法通过对10批六神曲炒制后的性状、显微鉴别、水分、灰分、浸出物等进行评估,制订“炒六神曲”质量控制标准。结果确定“炒六神曲”的性状,将处方中麦麸的果皮细胞、非腺毛,赤小豆的种皮表皮栅状细胞、苦杏仁的石细胞作为“炒六神曲”的显微特征,规定水分不得超过8.0%,总灰分不得超过5.0%,浸出物不得超过5.0%。结论本质量控制方法可靠,可用于“炒六神曲”质量标准的建立,填补吉林省内“炒六神曲”质量标准空白,为确保科学生产、保证监管有效、合理临床应用奠定基础。

六神曲化学成分及抗氧化活性研究

目的研究六神曲Massa Medicata Fermentata的化学成分及其抗氧化活性。方法六神曲乙醇提取物采用硅胶、MCI色谱柱、HPLC方法进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用清除DPPH、ABTS与超氧阴离子自由基能力评价六神曲总酚的抗氧化活性。结果从中分离得到21个化合物。六神曲中总酚含量约为1.68 mg/g,其对DPPH、ABTS与超氧阴离子自由基的IC_(50)分别为37.30、116.39μg/mL、1.17 mg/mL。结论除化合物6、9外,其余均为首次从该植物中分离得到。六神曲总酚具有良好的抗氧化活性。

基于物联网技术的六神曲生产全流程追溯监管体系构建

目的:构建基于物联网技术的六神曲生产全流程追溯监管体系。方法:梳理物联网技术在中药材种植生产环节、中药监管模式上的应用,对“浙产名药”六神曲种植生产追溯体系进行分析,构建六神曲种植生产监管模式。结果:以物联技术为核心、数据联通为主线、矩阵赋码为载体、流程可视为关键、“人机料法环”数字化呈现为重点,可实现六神曲种植生产全流程可追溯可监管。结论:在追溯过程中融入信息技术,有利于提高监督管理的质量与效率,从饮片质量管理层面保障了广大患者用药的安全性与有效性,建立基于物联网技术的新型监管模式、规范中药产业市场秩序具有重要的研究价值与现实意义。

中草药六神曲中微生物群落结构与发酵条件优化

研究旨在提高中草药六神曲饲料添加剂的应用效果。采用3因素(发酵温度、发酵湿度、料液比)3水平正交试验对发酵条件进行优化,以淀粉酶和蛋白酶活性为指标,结合极差分析法确定最优发酵条件和该条件下微生物群落结构与功能变化。结果表明,六神曲饲料添加剂发酵的最优条件为:温度37℃、湿度80%、料液比1.50 g/mL,该条件淀粉酶活性为31.70 mg/(min·g),蛋白酶活性为302.75μg/(min·g)。发酵过程中细菌类始终是主导菌群,变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门,在发酵前期较为丰富;发酵中期和后期,厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度逐渐升高为优势菌门。欧文氏菌属(Erwinia)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)始终为各发酵阶段优势菌属。真菌群落结构上,子囊菌门(Ascomycota)为优势菌门,曲霉属(Aspergillus)为优势菌属,均在发酵后期含量最高。新陈代谢功能在发酵前期相对丰度最高,腐生型真菌在全部发酵样品中占比均最高。研究表明,中药六神曲饲料添加剂的规范化生产可推广应用。

六神曲两步法发酵微生物群落结构及功能分析

六神曲可健胃消食,发酵方式分为一步法和两步法,该研究采用基于扩增子的高通量测序技术对六神曲两步法发酵过程及部分原料缺失时的微生物群落结构进行分析,并基于基因测序结果进行功能预测。结果表明,六神曲发酵过程中pH逐渐下降,微生物群落多样性显著降低,在发酵后期细菌以乳杆菌属(Lactobacillus)和片球菌属(Pediococcus)为主,真菌以毛孢子菌属(Trichosporon)为主;功能预测结果表明,六神曲发酵期间次级代谢产物的生物合成、不同环境中的微生物代谢、氨基酸的生物合成和碳代谢等相关基因有明显变化;发酵原料缺少青蒿、辣蓼、苍耳草或苦杏仁任何一种,细菌多样性均降低,而真菌多样性增加,其中乳杆菌属和毛孢子菌属的丰度均明显降低,片球菌属为优势菌。

UPLC-MS/MS法快速测定六神曲中的7种真菌毒素

目的建立快速测定六神曲中7种真菌毒素残留的超高效液相色谱-串联质谱方法。方法色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),流动相为乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol·L^(-1)甲酸氨溶液,梯度洗脱,流速为0.4 mL·min^(-1),柱温为30℃。采用电喷雾离子源,正离子模式,工作模式为多反应监测模式。结果该方法专属性好,7种真菌毒素在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数r在0.9987~0.9995之间,平均回收率为84.7%~108.0%,RSD为2.8%~5.8%(n=6)。实际样测定中,10批样品中共有2批检出黄曲霉毒素B1,含量分别为1.24,2.35μg·kg^(-1),其余毒素均未检出。结论该方法快速、简便、回收率高,适用于六神曲中真菌毒素的质量监测。

六神曲发酵过程中5种消化酶的动态分析

该文主要通过对六神曲发酵过程中产生的5种消化酶进行了系统而全面的分析,确定了六神曲的最佳成熟时间。研究发现,发酵过程中产生的5种消化酶存在规律性变化:糖化酶活力在发酵第3d时达到高峰,淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶的活力在发酵4d时达到高峰,之后4种酶活力均有所下降并逐渐趋于平稳;蛋白酶活力在发酵前4d变化不大,之后随发酵时间的延长活力显著增加。最终确定六神曲发酵的成熟时间为4d～6d,为六神曲的工艺及质量控制提供依据。消化酶的活力变化可以作为控制六神曲发酵工艺及质量评价的指标。

六神曲固态协同发酵工艺优化及物质动态变化研究

目的:优化六神曲固态协同发酵工艺并研究发酵过程中物质动态变化。方法:以枯草芽孢杆菌与赛氏曲霉为发酵菌种,蛋白酶和淀粉酶活力为指标,通过单因素实验确定最佳接种比例与发酵时间,采用正交试验优选发酵温度、湿度及接种量。采用HPLC测定六神曲发酵前后苦杏仁苷及青蒿素含量变化,另对发酵过程中两种菌株数量变化与酶活进行检测。结果:最佳发酵工艺为赛氏曲霉和枯草芽孢杆菌接种比例1∶2,时间8 d,温度30℃,湿度85%,接种量10%,蛋白酶与淀粉酶活力分别达到2.16 mg·min^(-1)·g^(-1)和74.84 mg·min^(-1)·g^(-1);苦杏仁苷在发酵后被分解代谢,青蒿素在协同发酵中被代谢但在自然发酵过程中含量基本不变,并且发现两种菌株数量变化与酶活有明显的相关关系。结论:协同发酵工艺条件稳定可行,为六神曲发酵工艺的规范化奠定基础。苦杏仁苷与青蒿素含量均不适合作为质量评价指标。

响应面法优化六神曲发酵工艺

目的:以淀粉酶活性为响应值,采用响应面法优化六神曲的发酵条件。方法:在赤小豆(氮源)添加量、发酵温度、发酵时间单因素的基础上,采用Box-Behnken响应面设计试验,从而确定最佳发酵参数。采用Design-Expert V8.0.6.1软件进行回归模型分析,最后得出六神曲最佳发酵工艺参数。结果:最佳发酵条件为赤小豆(氮源)添加量2.6 g/100 g麸面、发酵温度32℃、发酵时间3 d。通过比较预测值以及验证试验值发现,预测值酶活40.80mg/(min·g)与验证酶活42.61 mg/(min·g)相对误差小于5%,该模型可以更好的预测六神曲发酵后所含的淀粉酶活性。结论:用响应面分析法所得的参数可为六神曲生产过程中的发酵条件提供科学依据,具有一定的实际意义。

六神曲炮制过程中微生物的分离与鉴定

目的:揭示中药饮片六神曲传统发酵炮制工艺中有益微生物种群。方法:应用经典的微生物分离纯化方法,结合形态学考察和16S rRNA或18S rRNA基因序列分析,对六神曲发酵炮制过程中样品进行微生物的分离及初步菌种分类鉴定。结果:共分离获得细菌8株、酵母菌3株、丝状真菌4株。8种细菌分别为成团泛菌、溶血葡萄球菌、阿氏肠杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、戊糖片球菌;3种酵母菌分别为伯顿生丝毕赤酵母、汉氏德巴利氏酵母、库德里阿兹威氏毕赤酵母;4种丝状真菌分别为卷枝毛霉、总状毛霉、尔青霉、亮白曲霉。结论:六神曲传统发酵炮制工艺涉及多种微生物共同参与发酵过程,为后续建立六神曲现代发酵炮制工艺奠定了菌种基础。

市售六神曲质量研究

目的建立同时测定六神曲中4种主要成分含量的HPLC方法。方法采用YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm,5μm)的色谱柱,流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)溶液,梯度洗脱,二极管阵列检测器(DAD)全波长检测,检测波长280 nm,柱温30℃,流速1 mL·min-1,进样体积10μL。结果没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、槲皮素浓度分别在14.9~298μg·mL-1、12.8~256μg·mL-1、13.9~278μg·mL-1、14.3~286μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率分别为101.5%、99.0%、97.8%、96.2%。结论所建立的六神曲中4种成分含量测定法简单易行,可为六神曲中药材质量控制提供科学依据。