金磁微粒介导的抗六聚组氨酸多克隆抗体的纯化

制备了抗六聚组氨酸(6×Histidine,6×His)多克隆抗体,以金磁微粒为载体对其进行纯化得到了高纯度的抗6×His抗体.首先以EDC法制备出六聚组氨酸-血蓝蛋白(6×His-KLH)抗原并免疫家兔,得到的抗血清经初步纯化,采用ELISA法测定其效价;为去除多克隆抗体中抗KLH抗体,将表面固定有KLH的金磁微粒(金磁微粒-KLH)与多克隆抗体反应,抗KLH抗体通过抗原抗体反应被吸附在金磁微粒表面,磁性分离取上清,利用ELISA法对去除前后抗6×His及抗KLH抗体的效价进行测定,确定出最佳去除条件.实验表明,初步纯化的多克隆抗体中抗6×His抗体效价可达1∶20 000;金磁微粒表面KLH固定化容量可达700μg/mg,当金磁微粒表面KLH与多克隆抗体质量比为50∶3时,金磁微粒-KLH可有效地去除多克隆抗体中抗KLH抗体,去除效果较好,说明所采用的方法成功制备出了高效价的抗6×His多克隆抗体;金磁微粒-KLH可特异性去除多克隆抗体中抗KLH抗体,得到高纯度的抗6×His的抗体,为研究6×His融合蛋白纯化检测奠定了基础.

利用S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽(简报)

S层(Slayer)是由单一的蛋白或糖蛋白组成的薄层晶状结构，它广泛存在于古细菌和真细菌细胞的最外表面，可包裹整个细胞。S层在结构化学、形态学、遗传学以及物理化学等方面具有独特的性质，使之在生物技术、分子纳米技术和仿生学等领域蕴藏着广泛的应用潜力。近年来。

新型rhNDPK-A工程菌的构建及表达产物纯化研究

目的 :为简化纯化过程 ,获得有临床研究价值的rhNDPK -A蛋白 ,构建新型rhNDPK -A基因的表达质粒 ,利用 6×His标签以Ni+ -NTA亲和层析柱纯化蛋白。方法 :将抑癌基因nm2 3-H1从质粒PBVNMH1中亚克隆于带有纯化标签的表达载体pQE4 0中。IPTG诱导表达目的蛋白。通过镍离子螯合层析柱一步纯化法纯化目的蛋白。结果 :pQE - 4 0中亚克隆的nm2 3-H1序列完全正确 ;目的蛋白在大肠杆菌M15中的表达量可达 4 9.6 % ;Ni+ -NTA亲和层析柱一步纯化后蛋白纯度为 93%。结论 :构建了带有 6×His纯化标签的新型rhNDPK -A基因表达质粒pQE -nm2 3H1,所构建质粒能高效表达目的蛋白 ,利用Ni+ -NTA亲和层析柱简便高效地纯化了表达产物。

六聚组氨酸在重组蛋白中的位置对镍亲和层析的影响

目的研究六聚组氨酸在重组蛋白中的位置对镍亲和层析的影响。方法采用PCR法扩增目的基因,克隆人pMD18-T载体后进行序列测定。构建原核表达载体pET28-His-Cpn10-IL4与pET28-Cpn10-His-IL-4,在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达两种在不同位置带有六聚组氨酸(His-tag)的重组白细胞介素4(rhIL-4)融合蛋白。用SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达产物,采用镍亲和层析的方法纯化两种重组融合蛋白。结果Western印迹证实两种融合蛋白均可与抗组氨酸单克隆抗体特异性结合,但用镍亲和层析方法可以很好地分离纯化融合蛋白His-Cpn10-IL-4,却不能纯化融合蛋白Cpn10-His-IL-4。结论应用镍亲和层析的方法纯化融合蛋白时,His-tag在融合蛋白中的位置对蛋白质的纯化非常重要,His-tag可以在融合蛋白的N端和C端,但不能在中间。

生物工程技术制备人源抗-HBs Fab片段

目的:用生物工程技术制备人源性抗-HBs F-ah。方法:将从抗体文库中筛选出的人源抗-HBs Fab基因克隆人pBAD/gⅢA载体,进而转化Top10大肠杆菌。对重组质粒菌发酵表达后,利用Ni-NTA-Agarose螯合层析柱纯化周质腔可溶性Fab 蛋白。对所得包涵体依次变性、溶解、纯化后,利用透析进行复性。用Western blot检测Fab蛋白的特异性,Dot blot测定其生物学活性。结果:经Ni-NTA-Agarose柱纯化的周质腔可溶性Fab蛋白,有较好的生物学活性,并且总量达到80mg/L。对所获包涵体进行透析复性后,也可得到少量有活性的蛋白,但比例很小。结论:用pBAD/gⅢA-Top10表达系统表达人源抗-HBs Fab片段,发酵培养后,经有效纯化可得到生物学活性较好的可溶性蛋白,为人源抗-HBs Fab片段的大量制备提供了有效手段。

镍化磁性琼脂糖凝胶微球的制备及其在蛋白纯化中的应用研究

以自制磁性琼脂糖微球为基质,环氧氯丙烷为活化剂,亚氨基乙二酸作为螯合剂,制备了表面螯合Ni 2+的磁性凝胶微球(Mag-Agarose-Ni).IR结果表明Ni 2+成功螯合到了磁性凝琼脂糖胶微球上;SEM结果显示在螯合Ni 2+后,Mag-Agarose-Ni形貌没有发生明显变化,且平均粒径为23μm;原子吸收光谱结果表明MagAgarose-Ni表面螯合的Ni 2+的量为2.12×10-5 mol/mg;磁性能测试表明Mag-Agarose-Ni具有超顺磁性,其磁饱和强度为20.8emu/g,具有良好的磁响应性.将Mag-Agarose-Ni用于六聚组氨酸融合蛋白K8的纯化研究,SDS-PAGE结果表明Mag-Agarose-Ni较市售Ni-NTA对K8具有更优的亲和分离效果,经15min的孵育后,Mag-Agarose-Ni对K8的吸附容量可达到8.8μg/mg.

钴金属螯合亲和层析在hIGF-1融合蛋白分离纯化中的应用

为探讨钴金属螯合亲和层析应用于分离纯化制备人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)的可行性与纯化条件,以重组工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)为对象,使用钴亲和层析技术分离纯化其表达产物并与镍亲和层析比较,在此基础上尝试应用钴亲和层析分离纯化制备较大量的hIGF-1融合蛋白。结果显示,钴亲和层析在分离纯化hIGF-1融合蛋白时表现出更好的可操作性与纯化效果,线性放大条件后分离纯化效果稳定,制备hIGF-1融合蛋白产物纯度约为95%,蛋白获得率约为10.78%。研究初步建立了切实可行的钴金属螯合亲和层析分离纯化制备hIGF-1融合蛋白的工艺。