兰州鲇NPY基因的克隆和表达分析

针对兰州鲇人工驯食转化率、苗种培育成活率低等问题,为利用基因编辑技术创制和培育易驯食兰州鲇新种质,开展了兰州鲇神经肽Y基因(NPY)的克隆及其表达分析研究。结果表明:兰州鲇NPY基因cDNA序列全长为775 bp,包括288 bp的开放阅读框,编码95个氨基酸,含有1个跨膜螺旋和1个信号肽胰腺激素类识别结合位点。兰州鲇NPY蛋白序列与南方鲇的一致性最高,为98.95%。荧光定量PCR检测发现NPY mRNA在脑组织中表达量最高,其次是下丘脑,肌肉中表达量最低。不同年龄雄性各组织中NPY mRNA表达水平均高于雌性;且雌雄性别组间均表现出随年龄的增长NPY mRNA表达下降的特征。利用原位杂交技术进行脑组织细胞定位发现,脑细胞中NPY主要在细胞质中表达;不同部位脑组织中主要以前脑的视前区、视顶盖和脑垂体,小脑的豆状核区域以及延脑的尾状核区域表达量较丰富。进一步进行饥饿补偿验证发现,饥饿可引起脑组织NPY表达量显著升高,摄食后NPY表达量显著下降。上述结果表明,NPY基因可能在兰州鲇生长和摄食过程中都具有重要作用,可作为对后续功能基因进行编辑的重要验证并创制新种质,对加快兰州鲇良种新品种选育具有重要的理论意义和技术支撑作用。

兰州鲇Dmrta1基因克隆及其组织时空表达规律

为了解Dmrta1基因的生物学特性及其在兰州鲇生长发育中的生理作用,以及为加快实现全雄兰州鲇群体生产提供理论依据和技术支撑。采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得兰州鲇Dmrta1全长cDNA序列,通过qRT-PCR技术检测该基因在兰州鲇胚胎发育、仔稚幼鱼以及3龄雌雄异体和3龄雌雄同体不同组织中的表达特征。结果表明,兰州鲇Dmrta1基因cDNA全长1415 bp,ORF全长1158 bp,共编码385个氨基酸,包含20种氨基酸;经SMART预测显示,该基因属于典型的Dmrta亚家族蛋白,具有保守的DM和DMA结构域。同源性比对和系统进化树分析结果表明,兰州鲇与南方鲇的相似性最高(95.47%),且亲缘关系最近。组织表达结果表明,Dmrta1 mRNA在未受精卵粒及胚胎发育各个时期均有表达,而在未受精卵粒中表达最高(P<0.05);在兰州鲇孵化后40 d内不同发育时期中,Dmrta1 mRNA在同期XX个体组织中表达均显著高于XY个体,且在35 d迅速达到峰值(P<0.05);Dmrta1 mRNA在3龄雌雄异体兰州鲇雌性卵巢、鳃和雄性鳃组织中表达显著高于其他组织(P<0.05),且卵巢表达显著高于雌性和雄性鳃,除卵巢表达是精巢的47.07倍外,其他组织中不存在雌雄性别差异;3龄雌雄同体和3龄雌雄异体表达特征一致,都是卵巢表达显著高于鳃和精巢(P<0.05)。以上结果说明,Dmrta1基因属于母源基因,该基因可能在兰州鲇性别分化、卵子形成和鳃弓形成过程中发挥重要作用,在雌雄同体和雌雄异体兰州鲇性腺中的作用一致。

野生和养殖兰州鲇肠道菌群结构的比较

研究以不同生境兰州鲇群体为研究对象,通过细菌16S rDNA V3—V4区域高通量测序的方法,开展不同环境下肠道菌群组成、丰富度、多样性差异和功能预测的研究。实验共分为4组,其中养殖型为池塘组(CT)和网箱组(WX);野生型为陶乐组(TL)和磴口组(DK)。结果显示,兰州鲇肠道核心菌门为梭杆菌门(Fusobacteria)和变形菌门(Proteobacteria);核心菌属为鲸杆菌属(Cetobacterium)和邻单胞菌属(Plesiomonas)。肠道菌群α和β多样性分析结果显示,26.5℃较20℃的兰州鲇肠道菌群多样性更高;单一种类的网箱养殖较其他养殖模式的兰州鲇肠道菌群多样性更低。进一步对兰州鲇肠道菌群组成及丰度进行组间差异性分析,结果显示,CT组拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度与TL组有极显著差异(P≤0.01)、与WX组有显著性差异(P≤0.05);而CT组放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度显著高于野生型两组(P≤0.05),甲基杆菌属(Methylobacterium)丰度显著高于WX组和TL组(P≤0.05)。进一步结合环境因子分析表明,温度、pH和氨氮浓度可能是兰州鲇肠道菌群组成和丰度的重要影响因素。预测的肠道菌群功能表明,不同的环境会影响兰州鲇肠道菌群的代谢能力。综上所述,不同的生长环境对兰州鲇肠道菌群的组成、丰富度和预测的菌群功能具有显著影响,这有助于通过改善pH、温度和氨氮浓度,有效控制兰州鲇肠道菌群,进而降低兰州鲇患病概率和提高兰州鲇苗种的驯食转化率,从而促进兰州鲇养殖业的可持续发展。

兰州鲇人工繁育有关技术探讨

2022年5月,笔者作为陕西省水产研究与技术推广总站黄河科研团队一员在陕西新民家鱼原种场首次进行了兰州鲇的人工繁育研究工作,并取得初步成功,现就有关技术探讨如下。一、材料和方法1.兰州鲇亲本的来源2022年用于兰州鲇繁殖研究的第一批亲本为2021年冬季从黄河中捕捞的野生兰州鲇,经土池暂养半年后,从中挑选鱼体无病无伤、发育较好的兰州鲇。

温度对兰州鲇消化酶活性的影响

测定了兰州鲇(Silurus lanzhouensis)胃、肝胰脏、前肠、中肠、后肠在不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、37℃4、2℃、47℃)条件下的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性。结果表明,随温度的升高,各种酶活性的变化均表现为先增高后下降直至不能检出。消化道各部位蛋白酶的最适温度均为42℃;淀粉酶的最适温度除胃和肝胰脏为37℃外,其他部位均为30℃;脂肪酶的最适温度除后肠为30℃外,其他部位均为25℃。消化酶的最适温度高于其生活水域的水温,反映出消化酶作为酶蛋白的耐热性。最适温度下,蛋白酶活性前肠≈中肠>后肠>肝胰脏≈胃;淀粉酶活性前肠>中肠>肝胰脏>胃>后肠;脂肪酶活性中肠>后肠>前肠≈肝胰脏>胃。研究结果还表明,前肠和中肠是兰州鲇消化蛋白的主要部位,中肠是其消化脂肪的主要部位,而前肠是其消化淀粉的主要部位。在消化酶表现出活性的温度范围内,蛋白酶活性明显高于淀粉酶活性。实验还表明脂肪酶具有活性的温度范围较蛋白酶和淀粉酶窄。

兰州鲇肌肉生化成分分析及营养学评价

测定了黄河中上游特有鱼类兰州鲇的肌肉生化成分并对其进行了营养学评价。结果表明,兰州鲇肌肉(鲜样)中粗蛋白质量分数(17.4±0.7)%,粗脂肪(2.22±1.09)%,粗灰分(1.12±0.09)%,水分(80.4±0.8)%。肌肉中含有18种氨基酸,总量为(71.29±3.71)%(质量分数,干样),其中含量最高的为谷氨酸(10.43±0.47)%,含量最低的为胱氨酸(0.663±0.040)%,8种人体必需氨基酸总量为(30.24±2.18)%,占氨基酸总量的42.38%,其构成比例符合FAO/WHO标准。兰州鲇肌肉中限制性氨基酸为缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸,必需氨基酸指数(EAAI)为69.3,4种鲜味氨基酸总质量分数为24.62%(干样)。不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的65.21%,并以油酸(C18∶1)和亚油酸(C18∶2)为主。磷含量显著高于其余12种矿物元素(p<0.05),锌在8种微量元素中含量(10.18mg/kg,鲜样)最高,铁(8.31mg/kg,鲜样)次之,硒含量(0.31mg/kg,鲜样)丰富。从营养学角度,兰州鲇是一种营养价值较高的优质鱼类。

兰州鲇与鲇消化系统的形态学及组织学比较研究

为探究黄河濒危鱼类兰州鲇(Silurus lanzhouensis)消化系统的形态学和组织学结构特点,以鲇(Silurus asotus)为对照,对兰州鲇消化系统形态学和组织学进行了深入研究。结果表明:(1)兰州鲇与鲇的消化道和消化腺形态相似,具有肉食性鱼类的特征。兰州鲇消化道较短,有发达的"U"型胃,胃内皱褶明显,无幽门盲囊,肠道短且粗,可分为前肠、中肠和后肠三部分,前肠粗大,后肠较细。两种鲇属鱼类都有独立致密的肝脏和胰脏。(2)兰州鲇的比肠长显著大于鲇(P<0.05),比胃重、比肝胰脏重显著低于鲇(P<0.05),但二者的比肠重无显著性差异(P>0.05)。(3)兰州鲇胃的皱襞幅度小于鲇,且环肌层比兰州鲇薄。兰州鲇与鲇前肠的肠黏膜均形成了大量皱襞,肠黏膜、褶皱粗大,但鲇的褶皱分支较细密。兰州鲇与鲇的后肠与前肠相比,肠腔变小,褶皱数量明显减少,高度降低。黏膜层分布有杯状细胞和柱状细胞。兰州鲇与鲇的肝脏肝小叶间缺少结缔组织,分界不明显,而兰州鲇肝细胞的密度大于鲇。综上所述,兰州鲇与鲇的消化系统相似,均符合肉食性鱼类消化系统特征,结合消化生理等研究结果,表明兰州鲇的消化能力弱于鲇,这可能是在自然情况下兰州鲇的分布区域及适应性不及鲇的原因之一。

兰州鲇消化器官理化特征及pH值对其消化酶活力的影响

对兰州鲇(Silurus lanzhouensisChen)消化器官的理化特征及在不同pH条件下的消化酶活力进行了研究.结果表明,兰州鲇比肠长、比胃重、比肠重、比肝胰脏重、比内脏重分别为0.91±0.25、0.0158±0.0045、0.0112±0.0054、0.0199±0.0069和0.0916±0.0293;胃、前肠、中肠、后肠壁及胆汁的pH值分别为5.5~6.5、5.5~7.0、6.0~7.0、6.0~7.0和5.5~7.0;胃、肝胰脏和肠淀粉酶最适pH值分别为5.4、6.6和7.0,脂肪酶最适pH值分别为5.4(或5.8)、6.6和6.6.兰州鲇胃和肠的pH值环境均有利于淀粉酶和脂肪酶活力的发挥.在最适pH条件下,肝胰脏淀粉酶活力略高于肠,胃淀粉酶活力最低,而肝胰脏和肠的脂肪酶活力相同,胃脂肪酶活力最高.从消化器官特点和消化道内食物组成可以看出,兰州鲇消化生理特性与其肉食性特点相适应.

宁夏鲇属鱼类一新纪录种——兰州鲇形态学特征描述

2003年3月至2004年5月,在黄河宁夏段采集到一批鲇鱼标本。经鉴定,为鲇属(Silurus)宁夏一新纪录种———兰州鲇(Silurus lanzhouensis)。兰州鲇(S.lanzhouensis)与小背鳍鲇(S.m icrodorsalis)、鲇(S.asotus)、大口鲇(S.m eridionalis)、昆明鲇(S.m ento)、抚仙鲇(S.graham i)相似,但也有显著区别。兰州鲇犁骨齿带左右分离,与小背鳍鲇、鲇、大口鲇犁骨齿带连续相区别;兰州鲇臀鳍鳍条77-86、脊椎骨数目63-68,可与昆明鲇臀鳍鳍条61-72、脊椎骨52-56,抚仙鲇臀鳍鳍条68-74、脊椎骨58-59相区别。此外,兰州鲇卵色为黄色,可作为与黄河中生活的鲇相区别的鉴别特征之一。

基于第二代测序技术兰州鲇线粒体基因组全序列测定与分析

研究采用高通量第二代测序技术,构建获得兰州鲇(Silurus lanzhouensis)线粒体基因组全序列,并对全序列特征和结构进行了分析。研究结果表明,兰州鲇线粒体基因组全序列长度为16523 bp,碱基组成具有高A+T低G+C含量的偏向性,具有脊椎动物典型的结构组成。13个PCG基因中存在2种启动子(ATG、GTG)、3种终止子(TAG、TAA和T或TA)。除t RNA-Ser^(AGN)基因二级结构中DHU臂缺失,其余21个t RNA基因可折叠成典型三叶草结构。12S rRNA二级结构由45个茎环结构组成4个结构域,16S rRNA由54个茎环结构组成6个结构域。含有关键序列标签的控制区(CR)可分为3个不同的结构域:终止序列区(TAS1、TAS2)、中央保守区(CSB-F、CSB-E和CSB-D)和保守序列区(CSB1、CSB2和CSB3)。非编码区含有一段保守的控制轻链复制起始的序列区(O_L)。基于线粒体基因组全序列和通用标签COX1基因标记可区分兰州鲇同其他鲇形目鱼类种质进化关系。

磁珠富集法筛选兰州鲇微卫星分子标记

兰州鲇（Silurus lanzhouensis）又名黄河鲶，隶属于鲇形目（Siluriformes）、鲇科（Siluridea）、鲇属（Silurus），是我国黄河中上游特有的大型经济鱼类。肉质细嫩、少刺、味道鲜美，具有很高的营养价值，俗有“黄河鲶鱼活人参”之称[1]。但由于过度捕捞、水利工程等因素，兰州鲇野生种群数量日益减少，已被《中国物种红色名录》列为濒危物种[2]。

黄河兰州鲇肌体重金属及有机氯的污染特征

【目的】了解黄河濒危鱼类兰州鲇(Silurus lanzhouensis)肌体污染物的残留现状,为黄河濒危鱼类资源保护和黄河水域水产品质量安全评价提供背景资料。【方法】采用国标法,测定了黄河港口至三门峡段兰州鲇肌体中铜(Cu)、锌(Zn)、铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、硒(Se)、六六六(HCHs=α-HCH+β-HCH+γ-HCH+δ-HCH)、滴滴涕(DDTs=pp’-DDE+op’-DDT+pp’-DDD+pp’-DDT)等9种污染物的残留状况,并与相同生境中的黄河鲤(Cyprinus carpio)和鲫(Carassius auratus)进行了比较研究。【结果】兰州鲇肌体重金属残留水平远高于黄河鲤和鲫,Hg、Cu、Zn、Pb、Cd、Se等的检出率为100%,As的检出率为54.5%,HCHs和DDTs的检出率为0。研究水域鱼类肌体主要残留物为Hg、Se、Pb和Cd,其中Hg的残留量最高,但除1个兰州鲇样品Hg含量超标外,其他检测指标的超标率均为0。均值污染指数表明,兰州鲇肌体污染物残留属于正常背景或轻污染水平,且三门峡段兰州鲇的受污染程度高于港口段,与水质监测结果保持一致。黄河港口至三门峡段水体受Hg的污染程度最高,Pb和Cd次之,Cu和Zn最低。兰州鲇肌体中Cu与Zn、Pb与Zn、As与Zn及As与Pb含量之间存在显著的正相关关系(P<0.05)。【结论】黄河兰州鲇肌体污染物残留属于正常背景或轻污染水平,且主要受水质的影响。因此,应积极防治黄河水域污染,以加强对兰州鲇的资源保护,并确保食用安全。

不同季节中兰州鲇肌肉水解氨基酸

目的研究兰州鲇(Silurus lanzhouensis)肌肉中常规营养成分和不同季节中肌肉水解氨基酸的组成和含量。方法采用氨基酸自动分析仪测定肌肉中水解氨基酸。结果兰州鲇肌肉中含有18种氨基酸,组成和含量顺序未呈现出季节性变化特点;蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸这5种氨基酸的含量及氨基酸总量,均随季节的推移呈上升趋势,但在3个季节中仅有秋季显著高于春季(P<0.05);苏氨酸、丝氨酸和谷氨酸等9种氨基酸的含量和必需氨基酸总量等虽有季节性上升趋势,但在3个季节间均无显著差异(P>0.05);胱氨酸、组氨酸和精氨酸等4种氨基酸含量未呈现出季节性变化。结论兰州鲇是一种蛋白质含量较高的经济鱼类,肌肉中水解氨基酸的种类、含量顺序及多数氨基酸的含量在季节变化中有较大的保守性。

高效液相色谱法测定兰州鲇等鱼类肌苷酸的含量

为全面了解兰州鲇(Silurus lanzhouensis)肌肉品质,建立了兰州鲇肌肉中肌苷酸含量的高效液相色谱测定方法。样品经5%pH 6.5～6.8的高氯酸溶液提取,C18反相色谱柱分离,254 nm波长处测定,外标法定量,测定了兰州鲇、鲇(Silurus asotus)、黄河鲤(Cyrinus carpio)3种鱼类肌肉中的肌苷酸含量。结果显示:该方法线性关系良好,相关系数r≥0.999;灵敏度高,检出限为2.5×10-4g/kg;加标回收率≥94.0%;方法精密度好,RSD≤2.5%。兰州鲇、鲇和黄河鲤的肌苷酸含量分别为1.18 g/kg、0.733 g/kg和0.504 g/kg。

砷对兰州鲇组织中代谢酶活性及RNA和蛋白质含量影响

采用毒性试验方法,研究了安全浓度(1.288 mg/L)条件下亚砷酸钠(NaAsO2)对兰州鲇(Silurus lanzhouensis)脑、鳃、肝脏、肌肉4种组织中6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,以及RNA和蛋白质含量的影响。结果表明,染毒21d时,As(Ⅲ)可显著降低4种组织中G-6-PDH和LDH活性、RNA和蛋白质含量(P≤0.05)。撤毒后21d,除脑和肝组织中蛋白质含量未恢复到对照组水平(P≤0.05),肝脏中G-6-PDH活性超过了对照组水平(P≤0.05)外,其余各组织中G-6-PDH和LDH活性、RNA和蛋白质含量均可恢复到对照组水平(P>0.05)。以上结果表明,As(Ⅲ)对兰州鲇组织中代谢酶活性具有明显的抑制作用,可致组织细胞RNA损伤和可溶性蛋白质减少,但这种影响是可逆的,撤毒后一定时间内可恢复到正常水平。

兰州鲇肌肉营养成分分析及营养价值评价

利用常规肌肉营养测试方法测定、分析了体质量(278.6±26.7)g兰州鲇肌肉营养成分。试验结果表明,兰州鲇肌肉(鲜样)中各成分的质量分数分别为:水分77.63%,蛋白质17.43%,脂肪3.46%,灰分1.33%,无氮浸出物0.15%。肌肉中含有18种氨基酸,总量为78.28%(质量分数,脱脂干样),其中人体必需氨基酸总量是37.15%,占氨基酸总量的47.46%,必需氨基酸指数为72.15,必需氨基酸的构成比例基本符合FAO/WHO的标准;鲜味氨基酸含量为31.11%,占氨基酸总量的39.74%。脂肪酸中多不饱和脂肪酸(PUFA)占总脂肪酸的33.39%,二十碳五烯酸(EPA)与二十二碳六烯酸(DHA)的含量分别为5.12%、7.65%。微量元素比值合理。

兰州鲇线粒体基因组序列结构及系统发育分析

利用GenBank中欧洲鲇的线粒体基因组序列,设计出6对引物,通过PCR扩增产物直接测序和引物行走(primer walking)法测定了兰州鲇的线粒体基因组序列,并对其进行结构分析。兰州鲇线粒体基因组序列全长16524 bp,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和1个非编码区。用最大似然法对鲇形目11种鲇鱼线粒体基因组的13个蛋白质编码基因的核苷酸序列进行系统发育分析。结果显示,兰州鲇首先跟其他鲇科鱼类聚为一支,形成一个单系群,位于系统发育关系树的中部。

兰州鲇线粒体Cytb基因的克隆与序列分析

为克隆兰州鲇(Silurus lanzhouensis)线粒体Cytb基因全序列,根据欧洲鲇(Silurus glanis)线粒体基因全序列设计特异引物进行兰州鲇线粒体Cytb基因的PCR扩增,得到1138 bp兰州鲇线粒体Cytb基因序列。对兰州鲇和其他13种鱼的线粒体Cytb基因核苷酸和氨基酸序列之间进行同源性比较,结果显示具有较高的同源性,核苷酸同源性介于61.38%—91.12%,氨基酸同源性介于76.62%—95.52%。对兰州鲇、欧洲鲇、大口鲇(Silurus meridionalis)、鲇(Silurus asotus)、越南鲇(Silurus cochinchinensis)的Cytb基因之间进行碱基替代分析,结果显示兰州鲇Cytb基因与鲇之间替换率最低,值为8.87%,转换/颠换值为3.21;与越南鲇之间替换率最高,值为14.41%,转换/颠换值为1.83。对本文克隆的兰州鲇Cytb基因与王庆容等测定的兰州鲇线粒体Cytb序列进行序列差异分析,结果显示两者之间替换率为11.16%,存在127个变异位点,转换/颠换比为4.08,遗传距离为0.1230。由NJ法基于兰州鲇和其他13种鱼的Cytb基因序列构建的系统进化树,结果显示与传统的分类地位基本吻合。

兰州鲇与鲇形态特征和血清生化指标的比较研究

比较了黄河中上游水域中特有鱼类兰州鲇(Silurus lanzhouensis)与鲇(Silurus asotus)主要形态学特征和血清生化指标,以期对兰州鲇的资源保护和人工养殖提供参考。结果显示,兰州鲇的颌须长/全长显著大于鲇(P<0.05);眼径/全长以及口裂宽/全长两者无显著差异(P>0.05),但兰州鲇眼径显著低于鲇(P<0.05);兰州鲇血清谷丙转氨酶(ALT)显著高于鲇(P<0.05),血清钙(Ca)、磷(P)和白球比(A/G)显著低于鲇(P<0.05),血清谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白球比(A/G)、尿素(BUN)、总胆固醇(Chol)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)两者均无显著差异(P>0.05)。研究表明,兰州鲇眼径较小,第一颌须较长,2种鲇在形态和血清生化指标上存在一定差别,在钙磷矿物营养代谢上有较大差异,而在蛋白与脂代谢强度上有相似性。

兰州鲇个体繁殖力的研究

对兰州鲇个体繁殖力进行了研究,结果表明：兰州鲇的个体绝对繁殖力（F）为2.4-33.8千粒,其相对繁殖力（FL,Fw）分别为64.0-571.0粒/cm和7.0-33.4粒/g.兰州鲇的个体绝对繁殖力与体长呈线性关系,即F=1.390 3L-49.234（R2=0.928 4,P〈0.001）.个体绝对繁殖力与体重呈幂指数关系,即F=0.000 2W^1.72（R^2=0.812 7,P〈0.001）.兰州鲇个体的绝对繁殖力（F）和相对繁殖力（FL）与年龄、成熟系数、卵径呈正相关.