兰花病毒病分子生物学及抗病毒基因工程研究进展

建兰花叶病毒(CymMV)、齿兰环斑病毒(ORSV)和建兰环斑病毒(CyRSV)是危害兰花的主要病毒。文章综述这几种重要兰花病毒的病毒分子结构、分子检测、卫星RNA、DI RNA、SiRNA及其转基因研究进展,并就今后的研究重点和方向作了展望。

不同探针结构对应用微阵列技术检测兰花病毒结果的影响

根据黄瓜花叶病毒(CMV)、齿舌兰环斑病毒(ORSV)、建兰花叶病毒(Cym MV)、辣椒褪绿病毒(Ca CV)和落葵皱纹花叶病毒(Ba RMV)等5种危害较大的兰花病毒多重RT-PCR扩增产物序列,分别设计了5′端不同poly(d T)长短的探针,分别是:带poly(d T)15 spacer结构、带poly(d T)5 spacer结构、不带poly(d T)spacer结构,比较了3种探针紫外交联后的杂交效果。结果表明:5′端带poly(d T)15结构的探针杂交效率最高,而5′端不带poly(d T)结构的探针杂交效果极差,提示在探针设计时应选择在5′端带poly(d T)15结构以便获得更好的杂交效果。

利用ELISA检测两种兰花病毒的研究

建立了三抗夹心酶联免疫吸附法(TAS-ELISA)检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)的方法。共检测了浙江省内139个兰科样品和8个百合科样品,结果表明有31.7%的兰花检出CymMV,有28.8%的兰花检出ORSV。根据病毒外壳蛋白基因上下游保守序列设计了检测ORSV的引物,参照周国辉报道设计了检测CymMV的引物并对人工接种两种病毒的兰花进行了逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测,结果表明,RT-PCR检测结果与ELISA结果相一致,进一步证实本研究建立的TAS-ELISA,DAS-ELISA方法稳定可靠,重复性好,可应用于兰花上CymMV和ORSV两种病毒的早期诊断和检测。

云南部分兰花病毒病的病害调查及病原鉴定

对云南部分兰花种植区的文心兰、蝴蝶兰、大花惠兰上发生的病毒病进行了调查与病原鉴定。兰花感染病毒后,主要以在叶片形成黑褐色的坏死斑为主。在文心兰不同品种中,T系列的病毒病发病率最高。经电子显微镜、血清学和RT-PCR等方法综合鉴定,确定危害云南兰花的主要病毒为建兰花叶病毒(Cymbidi-um mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV),其中CyMV为优势种,有时出现CyMV和ORSV复合侵染的情况。

二温式多重RT-PCR同时检测两种主要兰花病毒的研究

根据建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,Cy MV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物,建立了二温式多重RT-PCR同时检测两种病毒的检测方法。用该方法对感染两种病毒的植株总RNA模板进行扩增,结果同时得到2条大小与实验设计相符的769bp(Cy MV)、1000bp(ORSV)的特异性扩增带。用该方法对随机抽取的39个蝴蝶兰样品进行检测,结果11个样品检测出Cy MV,阳性率28.2%;24个样品检测出ORSV,阳性率61.5%;6个样品同时检测出两种病毒。

广东地区两种兰花病毒病害的分子鉴定及检测

根据已报道的建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)基因组核苷酸序列,在其cp基因上下游设计PCR引物。CyMV预计扩增产物784bp,ORSV预计扩增产物604bp。以采集自广东省顺德的墨兰和文心兰表现病毒病症状的病株叶组织总RNA为模板,进行RT-PCR扩增。对预期大小的5个扩增产物进行克隆和测序,结果表明,来源于不同兰种或同一兰种不同兰场的病样CyMV引物扩增产物核苷酸序列存在少量差异,但均与世界各地的CyMV分离物cp基因高度同源;而来源于不同兰种的病样ORSV引物扩增产物核苷酸序列完全相同,与世界各地的ORSV分离物cp基因高度同源。因此可将侵染广东兰花的两种病毒鉴定为CyMV和ORSV。混合上述两种病毒的 PCR引物,采用双重RT-PCR扩增,对采自广东顺德23个兰场共153份样品进行病毒检测,76份(49.7%)检出CyMV,52份(34.0%)检出ORSV,2份(1.3%)同时检出CyMV和ORSV。

双重一步法RT-PCR检测2种主要兰花病毒

[目的]研究建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)双重一步法RT-PCR检测方法,为病毒的早期快速诊断提供技术支持。[方法]根据2种病毒的外壳蛋白基因的保守序列分别设计两对特异性引物,并进行双重与单一RT-PCR对比试验。[结果]结果在健康蜘蛛兰被人工接种病毒后第10天和第21天用一步法RT-PCR方法分别获得CymMV和ORSV与预期相符的约764和946 bp扩增产物条带;且双重一步法RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,出现两条与单一RT-PCR产物相对应的清晰条带,获得较理想的检出效果;扩增产物的核酸序列经BLAST分析,同源性均在85%以上,证实了检测结果的准确性。[结论]该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,适合于两种主要兰花病毒的同时快速检测。

检测兰花病毒的斑点酶联法的建立

本文建立了齿兰环斑病毒(Odntoglossum ringspot virus,ORSV)和建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)两种兰花主要病毒的斑点酶联法检测技术(Dot-ELISA)。用Dot-ELISA对提纯病毒和田间病叶进行检测,结果表明;检测ORSV和CyMV提纯病毒的灵敏度分别为0.82μg/mL和0.244μg/mL;病叶汁液的稀释倍数分别为1280倍和2650倍。该方法具有操作简便、成本低等优点,适合于兰花生产中的病毒检测。

一步式IC-RT-PCR同时检测2种兰花病毒的探讨

齿兰环斑病毒(Odontoglossum ring-spot virus,ORSV)和建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)复合侵染兰科植物的现象在自然界中非常普遍。通过设计一对简并引物可以同时扩增获得复合感染的兰科植物中两种病毒核酸片段(CymMV约558 bp,ORSV约825 bp),由此建立一步式免疫捕获-反转录-聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)技术以检测2种病毒的复合侵染情况。利用该技术对来自广东汕头的35株兰样进行感病性测试,发现31株呈阳性,感病率为88%。阳性株中,ORSV感染率为87%(27株),CymMV感染率为29%(9株),复合感染率16%(5株),说明这一地区ORSV感病率较高,并与CymMV存在明显复合感染。扩增条带T载体克隆测序表明,与已知CymMV和ORSV分离物的核酸分子平均同源性分别高达97%和99%。

双重一步法RT-PCR检测两种主要兰花病毒

根据建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）外壳蛋白基因的保守序列分别设计并合成1对特异性引物，建立了CymMV和ORSV的双重一步法IKT—PCR检测方法。该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点，在病害检疫中具有较好的应用前景。

上海辰山植物园兰花病毒病调查

采用DAS-ELISA、免疫层析胶体金试纸条、RT-PCR和小RNA深度测序检测方法,对上海辰山植物园53属124份兰花样品的病毒种类、被侵染兰花种类、症状进行了全面调查。结果表明:所测样品中仅含建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV),CymMV、ORSV和复合侵染的感染率分别46%、31%和23%,症状主要为黄绿斑驳嵌纹、黑色凹陷坏疽、叶肉皱缩变色、白拉丝等,感染CymMV、ORSV病毒的兰花分别有29、19个属,其中石斛、卡特兰、树兰、文心兰等属兰花病毒病的感染率较高,并据此提出了相应的防控建议。

可视化兰花病毒生物芯片检测方法与应用

为控制兰花种苗病毒病的传播,筛选出兰花无病毒种苗,需要建立一套兰花病毒检测的方法。可视化生物芯片检测技术是一种新颖的分子生物检测方法,具有准确性、简便性、高效性等优点。兰花病毒检测芯片试剂盒能同时检测兰科植物中 5 种常见病毒。文章对兰花病毒检测芯片的检测方法、特点及应用进行综述。

广东兰花病毒病调查和病原检测

本试验主要是采用症状观察和ELISA方法检测兰花病毒。检测材料是从广州兰圃、芳村兰场、华南植物园、深圳苗圃场采集的兰花标本。兰花病株症状类型有花叶、黑褐色坏死斑或斑块;有的叶片在褪绿处变薄,后变灰、干缩、破裂成丝。ELISA检测结果表明墨兰、文心兰、大花惠兰(组培苗)、蝴蝶兰、万代兰和卡特兰等几个品种共22个样本含有病毒,其中含有建兰花叶病毒(CyMV)的有10个品种,含有齿兰环斑病毒(ORSV)的有7个品种,同时含有两种以上病毒的有3个品种6个样本。

TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10^(-3)fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10^(-2)fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。

复合感染建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的兰花超微结构观察及病原物快速鉴定

通过负染和超薄切片观察到蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)病叶中线状和杆状病毒颗粒。组织切片观察,同时发现两种病毒粒子的典型聚集体:线状粒子的带状聚集体,粒子多层排列,层间呈一定角度或螺旋相叠;杆状粒子的平行、角层状或螺旋型排列聚集体。二种病毒聚集体均出现于薄壁细胞、细胞间隙和输导组织细胞中。感病细胞中叶绿体发育不全;线粒体增生、肿胀甚至空化;细胞核膨大、空化。进一步的多重RT-PCR与病毒核酸序列分析,同时扩增到建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的外壳蛋白基因,与GenBank已知分离物同源性分别达到98%和99%-100%。从细胞和分子层面揭示了蝴蝶兰受CymMV和ORSV复合侵染并可能导致严重病症的事实,分析和明确了感病兰细胞超微结构的病变特征以及田间病症发生的细胞病理学依据。

墨兰组织培养结合化学处理脱除建兰花叶病毒(CymMv)的研究

对墨兰原球茎顶端分生组织培养结合化学处理脱除建兰花叶病毒(CymMv)病原的效果进行了研究.取1～2 mm大小的墨兰原球茎顶端分生组织,经0,20和40 mg·L-1的三氮唑核苷浸泡15 min处理和继代培养,诱导再生植株.RT-PCR检测表明:从带病叶样提取的RNA经反向转录和PCR扩增反应,在琼脂糖凝胶电泳中检测到长为767 bp的CymMv病原特异扩增产物,而健康墨兰叶样中未检测到该扩增产物.单纯利用原球茎顶端分生组织培养获得的试管苗,脱毒率为72.9%;原球茎顶端分生组织经过20 mg·L-1的三氮唑核苷处理,可以获得100%的无病毒苗.虽然三氮唑核苷处理造成原球茎顶端分生组织细胞一定程度的伤害,但经过5～6个月的培养,分生组织能恢复生长,不定芽能有效地增殖,并获得了再生植株.当三氮唑核苷处理浓度为40 mg·L-1时,原球茎的顶端分生组织出现透明和褐变现象,细胞活力难以恢复.

建兰花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得3株能稳定传代并分泌抗CymMV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞(2C6、5B7和12G9),分别制备它们的单抗腹水。其中5B7和12G92株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,3株单抗的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测CymMV的方法。蝴蝶兰病叶作1∶10240倍稀释、提纯CymMV病毒浓度为4.87ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.487ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA方法检测了田间样品,发现CymMV在兰花上发病很普遍。

广东兰花两种主要病毒的检测

采用双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)对44个兰花病样分别检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV),结果显示,有59.1%的兰花检出CyMV,36.4%的兰花检出ORSV,22.7%的兰花复合感染了CyMV和ORSV。采用一步逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对24个兰花病样进行检测,结果有83.3%的兰花检出CyMV,75%的兰花检出ORSV,66.7%的兰花复合感染了CyMV和ORSV,可见RT-PCR检测灵敏度高于ELISA。

国产蝴蝶兰种苗携带建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的调查及脱毒的初步研究

采用双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)对国内不同蝴蝶兰种植场的17个蝴蝶兰分生苗品系种苗(22个样本)携带的2种主要病毒(CymMV和ORSV)的情况进行了检测调查,并采用茎尖培养和原球茎诱导的方式对携带病毒的4个蝴蝶兰品系进行了脱毒研究。结果表明:22个样本中有20个样本复合感染2种病毒,仅有1个样本显示了阴性结果。采用茎尖培养的‘R-2-2’和‘Y-4-2’品系,其脱毒率分别为22.7%(CymMV)和19.1%(ORSV),30.3%(CymMV)和8.0%(ORSV);采用原球茎脱毒的‘R-1-2’和‘R-11-1’品系,其脱毒率分别为25.4%(CymMV)和1.4%(ORSV),25.2%(CymMV)和24.2%(ORSV)。茎尖培养和原球茎诱导方式均不能一次性彻底脱毒。

建兰花叶病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)是引起兰科植物病毒病的最重要病原体。研究根据NCBI上已登录的CyMV外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因保守区设计两对特异性引物,用RT-PCR法从感病蝴蝶兰中克隆到2条CyMV CP基因序列,编码区ORF长672 bp,编码223个氨基酸。序列分析表明这两个分离物之间有13个核苷酸差异,与已报道的其他地区CyMV分离物CP基因核苷酸相似性分别为97%~99%和97%~98%,氨基酸相似性分别为95%~99%和96%~100%。运用实时荧光定量RT-q PCR法对该病毒检测方法进行了一系列条件优化,建立起一套基于SYBR Green I的CyMV实时荧光定量PCR检测体系。该检测方法比普通RT-PCR法灵敏度高100倍,标准曲线循环阈值(Ct)与模板浓度的对数呈现良好的线性关系,扩增效率为100%,相关性系数为0.998。重复性试验表明组内及组间变异系数均在2.58%以内,表明该方法重复性较好,可为兰花CyMV的早期预警及病毒在植物体内侵染途径研究提供技术支持。