乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA清除的研究进展

乙型肝炎是感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起肝脏慢性炎症性改变为主要特征的一类传染病。长期慢性感染将导致肝纤维化、肝硬化、肝癌等终末期肝病的发生,严重危害人民群众的健康。慢性乙型肝炎病毒感染依然是全球公共卫生健康问题之一。目前临床上使用的抗病毒治疗方案难以实现对乙型肝炎病毒的彻底清除,其根源在于被感染肝细胞核内持续存在具有稳定结构的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)。本文对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA清除的研究进展进行综述,旨在寻找清除cccDNA的途径及办法从而达到乙型肝炎病毒的彻底清除。

改良聚合酶链反应检测HBV共价闭合环状DNA

目的:建立一种基于聚合酶链反应(PCR)的简便快速、具有较高敏感性和特异性的检测乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的方法.方法:分别提取HepG2.2.15细胞内的cccDNA及培养上清中的松驰环DNA(rcDNA)样品,试剂盒纯化;设计2对特异性引物,其扩增区域跨越rcDNA单链区;设计2对非特异性引物,扩增区域位于rcDNA双链区.经单链特异性绿豆芽核酸酶(MBN)分别消化cccDNA及rcDNA样品;以特异性引物和非特异性引物对消化前后的两种样品分别进行PCR扩增,并改变PCR扩增参数如底物数量、循环次数等,观察特异性引物能否顺利扩增消化后的cccDNA,同时又不扩增消化后的rcDNA.HBV基因组质粒样品作为对照.此外还采用实际乙型肝炎患者体内病毒样本检验此策略的实用性.结果:分别以非特异性引物和特异性引物扩增不同模板数的HBVrcDNA样品,2对非特异性引物可扩增出模板数在102以上的HBVrcDNA样品,2对cccDNA特异性引物也可以扩增出模板数在104以上的样品.特异性引物在PCR反应模板数较多时将不能区分消化前的rcDNA和cccDNA.不同数量HBVcccDNA和rcDNA模板在MBN消化前后,分别应用非特异性引物和特异性引物进行PCR扩增,发现不同数量的cccDNA模板分子经过MBN消化后,仍可用特异性引物和非特异性引物扩增出相应条带;rcDNA样品经过MBN消化后,非特异性引物可扩增出产物条带,而特异性引物无法扩增出条带.采用此种策略,我们发现慢性乙肝患者血清HBV核酸样品主要成份为rcDNA,并带有少量cccDNA,而肝细胞内HBV核酸样品富含cccDNA,与实际情况一致.结论:联合应用MBN选择性消化和cccDNA特异性引物的PCR检测法简便快速,敏感性和特异性均较满意.

肝癌患者肝组织中乙肝病毒共价闭合环状DNA表达水平及与e抗原相关性研究

目的:定量分析乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的肝癌患者肝内共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)、DNA和血清中DNA的表达水平,并分析其与乙肝病毒e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)状态的相互关系。方法:运用特异性荧光定量探针法检测了26例HBV感染的肝癌患者中HBV cccDNA和HBV DNA的表达水平,进一步分析这两种病毒因子在HBeAg阳性和HBeAg阴性样本中的表达差别以及与HBeAg状态的关系。结果:HBV cccDNA和HBV DNA在HBeAg阴性组的表达水平均显著低于HBeAg阳性组(P值分别为0.044和0.0214),同时,在HBeAg阴性组中,cccDNA的表达水平与DNA是显著正相关的(r=0.918,P=0.000);HBeAg阳性组中cccDNA与DNA是较弱的正相关关系,且不具有显著性(r=0.591,P=0.072)。结论:肝内cccDNA与DNA表达水平与HBeAg的状态是密切相关的,HBeAg阴性的HCC患者中病毒复制水平下降的原因主要是cccDNA水平的下降。

慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA定量检测的临床意义

目的探讨慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)的临床意义。方法选取经肝组织病理学诊断的慢性乙型肝炎患者57例,其中乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性37例,HBeAg阴性20例;肝组织炎症轻度33例,肝组织炎症中度24例。采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)同时定量检测其血清HBVDNA和cccDNA。结果HBeAg阳性组血清HBV cccDNA对数值和阳性率分别高于阴性组,8.1±1.3vs6.5±1.9,73.0%vs30.0%(均P<0.01)。肝组织炎症轻度组(G1～G2)血清HBVcccDNA对数值低于中度组(G3),7.1±0.4vs8.5±0.4(P<0.01)。血清cccDNA与丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶呈正相关(r=0.612、0.632,均P<0.05)。结论血清HBVcccDNA为病毒复制的标志物,与肝组织细胞损伤相关。

共价闭合环状DNA在肝病发展中的作用

肝病在国内是一种重要而难治的疾病,主要包括急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化和肝癌。多年研究发现,cccDNA在肝病发展的每个过程中起着重要的作用。尽管有些具体机制不是很清楚,此文就cccDNA在肝病中的作用作一综述。

环介导等温扩增(LAMP)试剂盒检测石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)

目的建立一种检测石蜡包埋的肝组织中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的新方法,并探讨其应用价值和临床意义。方法提取30例慢性HBV感染患者的石蜡包埋肝组织中的DNA,采用质粒安全ATP依赖性DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)消化,去除非cccDNA后,加入引物及Bst DNA酶进行环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),将检测结果与临床实验室资料结合并进行分析,以判断其临床应用价值。结果 30例HBV感染患者中,有17例HBV cccDNA阳性,阳性检测率56.67%。其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(轻-中度)3例。提示肝组织HBV cccDNA阳性可能与疾病进展密切相关,与血清HBV cccDNA阳性有一定的相关性,与乙型肝炎病毒血清免疫标志物以及肝功能状况无明显相关。结论 LAMP法能检测到石蜡包埋肝组织中的HBV cccDNA,结合临床实验室资料,对判断抗病毒药物疗效及研究乙型肝炎致病机制具有一定的意义。

慢性乙型肝炎患者血清共价闭合环状DNA检测的临床意义

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者血清中共价闭合环状DNA(cccDNA)的临床检测意义。方法随机选取进行肝组织活检的CHB患者57例。用实时荧光定量PCR法分别检测入选病例血清中cccDNA值,同时定量检测血清中HBV DNA水平,对比HBeAg阳性组和HbeAg阴性组cccDNA水平,并分析cccDNA与HBV DNA、病理炎症分级、ALT的关系。结果 HBeAg阳性组血清中cccDNA水平明显高于HBeAg阴性组(P<0.05);HBeAg阳性组血清中cccDNA与HBV DNA存在正相关关系(P<0.01);cccDNA水平和肝组织炎症活动度及ALT水平比较均无显著性差异(P均>0.05)。结论血清中HBV cccDNA定量是评价HBV复制最客观可靠的指标,在CHB诊断及抗病毒治疗中具有重要意义。

原位聚合酶链反应检测肝细胞内乙型肝炎病毒共价闭合环状的DNA表达

目的探讨乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV-cccDNA)在慢性乙肝患者肝细胞中的表达及意义。方法选取活动性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化患者肝穿或重症乙肝患者尸检肝组织标本50例,经10%甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,用0.05%多聚赖氨酸处理后使用。分别设立无引物、无地高辛标记引物、无TaqDNA聚合酶PCR反应体系及非乙肝患者肝组织共10例作为阴性对照。采用原位PCR技术进行HBV-cccDNA检测。结果HBV-cccDNA在乙肝患者肝细胞中阳性表达以核型为主,呈蓝紫色,在肝细胞中总阳性表达率为60%～85%;偶见于细胞浆中,对照组均为阴性。结论原位PCR可以在肝细胞原位检测出HBV-cccDNA,阳性信号以核型为主,提示HBV-cccDNA主要存在于细胞核中,为乙肝病毒持续感染及复制的根源。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA在慢性乙型肝炎治疗中的分子生物学研究进展

在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染过程中,共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒复制产生的所有RNA和新病毒颗粒合成的模板,而当前的治疗方法很难彻底清除cccDNA.在cccDNA的产生过程中,由病毒前基因组RNA反转录合成松弛环状(relaxed circular,r c)DNA的细节目前已经比较明确,而对rcDNA转变为cccDNA的过程人们还知之甚少.最近的研究把cccDNA的形成和细胞DNA修复联系起来,并表明此过程是病毒与细胞相互作用的关键环节.本文将综述cccDNA的分子生物学研究进展,分析当前研究中遇到的障碍,并讨论把cccDNA作为治疗慢性乙型肝炎的靶点的前景.

针对共价闭合环状DNA的抗HBV治疗进展

慢性乙型肝炎HBV ccc DNA在肝细胞内的持续存在是阻碍慢性乙型肝炎治愈的关键之一。现有抗HBV治疗尚不能作用于HBV ccc DNA。随着对于HBV ccc DNA生成以及功能基础研究的不断深入,研究者开始从不同角度设计针对ccc DNA的治疗策略:干扰素-α以及淋巴毒素β-受体激动剂通过APOBEC3特异性降解ccc DNA,通过RNA干扰来抑制rc DNA进入细胞核,通过DNA剪切酶CRISPR-Cas9等靶向降解ccc DNA,通过作用于ccc DNA表观遗传学修饰以及通过作用于肝细胞代谢等影响ccc DNA功能。这些细胞和动物研究结果提示可降低ccc DNA水平或抑制ccc DNA的功能,给HBV彻底清除带来了希望。

HBV共价闭合环状DNA的表观遗传调控:对慢性乙型肝炎进行表观遗传治疗的启示

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的世界公共卫生问题。慢性乙型肝炎(简称慢乙肝)难以治愈的主要原因之一是难以清除作为病毒基因组保存形式和病毒转录模板的HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)。HBVcccDNA是被宿主组蛋白和非组蛋白修饰而稳定存在的游离病毒基因组。越来越多的证据表明,cccDNA的表观遗传修饰有助于病毒复制和慢性HBV感染的结局。

靶向核定位序列siRNA对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA复制的抑制作用

目的针对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区设计并化学合成2条小干扰RNA(siRNA),观察其对共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)水平的影响。方法将siRNA转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG2.2.15细胞,转染后72 h,采用ELISA方法检测上清液中HBsAg、HBeAg的含量,采用Real-time PCR定量检测细胞内cccDNA及细胞培养上清HBV DNA拷贝数。RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果。结果靶向NLS区的2条siRNA均能不同程度地降低HepG2.2.15细胞cccDNA水平,抑制HBV DNA的复制及HBeAg的分泌,对cccDNA的抑制率分别为93.30%和85.00%(P<0.01),对HBV mRNA抑制率分别为62.80%和48.90%,对HBV DNA抑制率分别为76.56%和66.41%(P<0.01),对HBeAg抑制率分别为57.25%、43.48%(P<0.01)。而无关序列对HBV DNA与cccDNA的复制和HBeAg表达几乎无干扰作用。结论靶向HBV核心蛋白C末端核定位序列的siRNA可特异、高效、稳定地显著降低HBV cccDNA水平,抑制HBV DNA复制及HBeAg分泌,为应用RNA干扰治疗HBV感染奠定了一定基础。

利用乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA构建慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型

目的通过水动力法注射乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)构建C57BL/6小鼠慢性乙型肝炎病毒感染的模型。方法取29只C57BL/6小鼠,分为实验组、对照组和空白组,应用水动力法分别注射HBV cccDNA、pAAV-HBV1.2及等渗盐水,于注射后收集不同时间点的血清和肝组织。利用放射免疫法检测血清样本中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg);荧光定量PCR检测血清和肝组织中HBV DNA拷贝数;免疫组织化学法检测肝组织中HBsAg和乙型肝炎病毒核心抗原(HBc Ag)的表达;苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化;使用SPSS 17.0对数据进行统计学分析。结果实验组HBsAg和HBeAg表达均呈现4个上升-下降曲线:HBsAg峰值分别出现在第3天、第3周、第7周和第9周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第1周、第4周和第10周。对照组HBsAg和HBeAg表达分别呈现2个或3个明显的峰:HBsAg峰值分别出现在第3天和第8周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第3周和第10周。空白组未检测出HBsAg和HBeAg。实验组HBV DNA拷贝数高于对照组的拷贝数(P<0.01);肝组织中HBV DNA拷贝数高于同期血清中的拷贝数(P<0.01);实验组和对照组的肝组织中均有HBsAg和HBc Ag的表达;实验组与对照组出现肝脏细胞炎症、肝细胞纤维化、肝细胞坏死等病理变化,而空白组正常。结论利用水动力法向C57BL/6小鼠体内转入HBV cccDNA,成功建立了慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型,与对照组比较,新建立的小鼠乙肝模型具有更高的HBV表达,动物模型为研究乙型肝炎病毒HBV cccDNA的感染及其引起肝损伤的机制奠定了基础。

慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的定量检测

目的探讨肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV CccDNA）水平与病毒复制、肝组织损伤的关系。方法应用荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法检测46例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV CccDNA水平,同时检测肝组织和血清中HBV DNA、肝细胞乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎核心抗原（HBcAg）表达及肝功能。结果将肝组织中HBV CccDNA定量水平分为低（〈104copies/mg）、中（104-106copies/mg）、高（〉106copies/mg）3组,3组中HBsAg阳性表达差异无统计学意义,但105~106copies/mg和〉107copies/mg组HBcAg阳性表达高于〈104copies/mg组,分别为105-106copies/mg组HBcAg表达14例（63.6%）和〉107copies/mg组7例（77.8%）vs〈104copies/mg组2例（13.3%）（P〈0.01）;HBeAg阳性组肝组织中HBV CccDNA和肝组织总HBV DNA均显著高于HBeAg阴性组,分别为肝组织中HBV CccDNAHBeAg阳性组（8.72±1.94）log10copies/mg vs HBeAg阴性组（6.54±1.56）log10copies/mg;肝组织中HBV DNAHBeAg阳性组（7.45±1.82）log10copies/mg vs HBeAg阴性组（5.27±1.48）log10copies/mg（均P〈0.01）;肝组织中HBV CccDNA与肝组织总HBV DNA、血清HBV DNA呈正相关（均P〈0.05）;而与肝组织炎症程度、肝纤维化程度、丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）无相关性。结论肝组织中HBV CccDNA定量能准确反映病毒复制水平,但不能将其视为肝组织损伤的标志。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测方法及临床应用研究进展

近年来,随着乙型肝炎的研究不断深入,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）共价闭合环状DNA（covalently c1osed circular DNA,cccDNA）引起了广泛的关注.它被认为是HBV在细胞内开始复制并建立感染的重要标志和抗病毒后乙型肝炎复发的主要原因[1],这些特性使得cccDNA成为了乙型肝炎研究中的一个关键点,清除cccDNA已成为目前抗HBV药物研究的一个重要目标[2-3].

共价闭合环状DNA检测方法的研究进展

对共价闭合环状脱氧核糖核酸的检测已成为乙型肝炎患者的临床药物试验研究及病理诊断的重要检验方法。目前,普遍采用三种对共价闭合环状脱氧核糖核酸定量检测的方法:选择性聚合酶链反应法,侵入者探针法和嵌合引物荧光聚合酶链反应法。每种方法均有各自的原理和优缺点,同时对提高检测的特异性,避免假阳性发生等方法学上的内容有共同点。由于目前尚未标准化,临床需根据实际选择合适的方法,使检查在操作,结果和价格上达到最大的优化。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA研究进展

共价闭合环状DNA(cccDNA)是乙型肝炎病毒的原始复制模板,对乙型肝炎病毒的复制具有重要的意义,药物难以清除。近年来,国内外对cccDNA的研究取得了新的进展,学者们对不同标本中cccDNA的检测,及临床上对cccDNA的清除等进行了广泛的研究。现就有关乙型肝炎病毒cccDNA方面的研究进展予以综述。

体外培养细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立

目的:建立一种体外培养细胞内乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的检测方法。方法:Southern blot检测HBV复制中间体,以确认HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞是否支持HBV复制;用Hirt法分别提取细胞内的去蛋白DNA(protein-free DNA,PF DNA),经加热变性处理,EcoRⅠ酶切,然后用Southern blot检测HBV cccDNA;用同样方法检测不同培养时间的HepAD38细胞内cccDNA,观察培养时间对cccDNA积累量的影响。结果:用Southern blot可在HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞中检测到HBV复制中间体;Hirt法提取物经变性和酶切处理,可有效地将cccDNA与其他形式HBV DNA区分开;HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞内均可检测到HBV cccDNA;HepAD38细胞在铺满后继续培养的时间较长时,其细胞内cccDNA的量较多。结论:成功建立了体外培养细胞内HBV cccDNA检测方法,该方法结合Hirt提取法和地高辛探针Southern blot方法,能可靠、准确地检测HBV cccDNA。

应用微环DNA技术体外诱导和制备重组的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒慢性感染的分子基础。本课题组前期研究通过Cre/loxP介导的位点特异性DNA重组策略,在细胞核内由前体质粒诱导重组cccDNA(rcccDNA^(loxP))产生,首次建立了HBV cccDNA的体外培养细胞和小鼠实验模型。本研究基于大肠埃希菌ZYCY10P3S2TPhiC31重组酶诱导表达系统,建立了一种体外诱导HBV rcccDNA(rcccDNAattR)微环产生和纯化的策略。纯化的rcccDNA^(attR)微环具有超螺旋结构,细胞培养实验证实其能支持功能性的HBV复制和抗原表达。与普通的线性HBV复制子编码质粒相比,rcccDNA^(attR)尾静脉高压注射小鼠模型能诱导显著延长的病毒抗原血症。因此,本研究在原核表达系统和实验小鼠水平提供了一种更为简化的HBV cccDNA实验模型系统,并再次显示rcccDNA具有显著的稳定性,能作为一种基本策略在小鼠模型中诱导病毒持续感染。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究现状

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）在病毒持续感染、停药后复发及药物抵抗等方面起关键的作用。本文对cccDNA形成机制、代谢调控、研究模型、检测方法和临床应用进行了简要综述。