肝纤维化3D共培养体外模型的研究进展

肝纤维化是慢性肝病的晚期阶段,最终可能导致肝硬化、肝功能衰竭甚至肝细胞癌。肝纤维化是细胞外基质(ECM)在肝脏过度沉积和异常分布的病理生理过程。肝星状细胞(HSC)活化是肝纤维化的核心事件,其被激活并分化为肌成纤维细胞,可以分泌大量的细胞外基质。肝脏巨噬细胞和其他免疫细胞的参与以及各种炎症因子和促纤维化因子的共同作用决定了肝纤维化进程的复杂性。尽管目前已有各种病因诱导的肝纤维化动物模型用于研究,但是依然缺乏有效的体外模型来深入探究肝纤维化发病机制及药物研发。因此,迫切需要开发一种更接近在体的肝纤维化体外模型,作为了解疾病和筛选新药的有效手段。本文将对近年来发展起来的肝纤维化3D共培养体外模型作一概述。

一种产氢产乙酸菌互营共培养体的筛选及其群落结构解析

厌氧消化系统中的产氢产乙酸菌在营养生态位上位于产酸发酵菌群和产甲烷菌群之间,在功能上起着承上启下的重要作用。该菌群具有与耗氢菌互营共生的特性,其分离纯化非常困难。为了深入了解其生理生态特性,为开发高效的厌氧生物处理技术提供理论基础,采用丙酸和丁酸混合培养基,以具有甲烷发酵功能的厌氧活性污泥为出发菌群,进行了产氢产乙酸菌互营共培养体的选育,并借助于PCR-DGGE技术对其菌群结构进行了解析。经过选择培养基的不断传代培养,最终筛选到2个产氢产乙酸互营共培养体7-m-2a和11-O-1。这2个共培养体不仅对丙酸和丁酸具有很强的降解和产乙酸能力,而且不产甲烷和硫化氢。在这种非产甲烷菌和非硫酸盐还原菌与产氢产乙酸菌组成的互营共培养体中,含有专性的互营产乙酸菌Desulfotomaculum sp.Iso-W2及其伴生菌,其中的伴生菌是能利用甲酸盐和H2/CO2的Uncultured bacterium 054E12_B_DI_P58和Sedimenti bactersp.JN18_A14_H。对这一新的产氢产乙酸菌互营共培养体的发现和选育成功,为更全面地研究产氢产乙酸菌的生理生态特性提供了样本。

一个产氢产乙酸菌互营共培养体的培养基优化

营养生态位位于产酸发酵菌和产甲烷菌之间的产氢产乙酸菌,其分离培养困难,种子资源匮乏,限制了基于强化产氢产乙酸功能作用的高效厌氧生物处理技术的开发.在前期获得对丙酸具有较强降解能力的产氢产乙酸菌互营共培养体7-m-2a的基础上,探讨了丙酸质量浓度、氮源、Ca2+、Fe2+、Mg2+和泛酸等对其生长代谢的影响.结果表明,培养基中适宜的丙酸钠和Fe2+、Mg2+、泛酸质量浓度分别为10 g/L和88、38、30 mg/L,最佳氮源是由质量浓度为0.33 g/L的酵母膏、胰蛋白胨和NH4Cl组成的复合氮源.在优化条件下38℃培养30 d,7-m-2a对丙酸的降解速率和乙酸产量分别可达998 mg/(L.d)和3 947 mg/L.

产氢产乙酸互营共培养体7-m-2a的生长代谢特性

为了对产氢产乙酸互营共培养体的扩大培养和应用奠定基础,采用静态培养实验,考察了碳源、氮源、温度和pH等因素对前期分离得到的新型共培养体7-m-2a的生长代谢特性的影响.结果表明,产氢产乙酸互营共培养体7-m-2a对丙酸、丁酸和苯甲酸都具有很高的转化率,其最适宜碳源为丁酸,不易利用葡萄糖和蔗糖;以蛋白胨和酵母粉混合物为氮源时,其生长代谢活动最旺盛,适宜的pH和温度分别为8.0和45℃.

不同来源牛体外胚胎与牛子宫内膜细胞共培养体系的建立

为了初步建立有效的牛胚胎与子宫内膜细胞的体外共培养体系。本实验分别将体外受精第7天后的胚胎和孤雌激活,与培养7天的胚胎与子宫内膜细胞共培养,在48、72h后分别统计体外受精实验组和孤雌激活实验组的孵化率。实验结果表明:在本实验室培养条件下,在与子宫内膜细胞共培养48h后,体外受精胚胎和孤雌发育胚胎在孵化率上存在显著差异(40±5)%、(25±5)%,(P<0.05);与子宫内膜共培养72h后,孵化率无显著差异(70±8.66)%,(65±5)%,(P>0.05)。本实验证明了在体外环境下,牛体外胚胎与子宫内膜细胞共培养后能够正常孵化,可以初步建立起牛体外胚胎与子宫内膜细胞的体外共培养体系,并为进一步研究该体系对牛体外胚胎培养质量的影响奠定一些基础。

芒柄花素对人表皮共培养体黑素合成的影响

目的观察芒柄花素对人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系模型(人表皮共培养体)中酪氨酸酶活性及黑素合成的影响。方法建立人表皮共培养体,建成后分别加入30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L芒柄花素,熊果苷为阳性对照组,测定芒柄花素和熊果苷对人表皮共培养体中酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响。结果芒柄花素3种浓度对人表皮共培养体中酪氨酸酶活性及黑素合成与对照组比较均有明显抑制作用(P<0.05),且浓度越高抑制作用越明显(P<0.05)。高、中浓度芒柄花素黑素抑制率高于熊果苷(P<0.05)。结论芒柄花素对黑素合成有明显抑制作用,机理与其对酪氨酸酶活性有抑制作用相关。

角质形成细胞和黑素细胞体外共培养体系的建立

目的构建角质形成细胞和黑素细胞体外共培养模型。方法胰酶消化包皮的表皮作为细胞来源,获取黑素细胞和角质形成细胞。结果角质形成细胞与黑素细胞混合培养5天后,细胞培养基逐渐变成浅灰色,再继续培养,培养基的颜色加深,细胞生长状态良好。结论成功构建了角质形成细胞与黑素细胞体外共培养模型,为色素问题的进一步研究奠定了基础。

中药对SiHa-CTL-Treg共培养体系中CTL细胞CTLA-4、PD-1蛋白的影响

目的通过检测细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)、程序性死亡配体-1(PD-1)的蛋白表达情况,了解清毒栓是否可以抑制调节型T细胞(Treg)的功能来改变局部免疫微环境而达到抑制肿瘤。方法免疫磁珠分选Treg、细胞毒T淋巴细胞(CTL);Western-Blot法检测CTLA-4、PD-1蛋白表达。结果 CTL与Treg共培养组,CTLA-4、PD-1的蛋白表达量明显增加,β-榄香烯及清毒栓干预后CTLA4、PD-1的蛋白表达量显著降低,且清毒栓组蛋白表达量降低的更加明显。结论β-榄香烯、清毒栓都可以抑制Treg对CTL中CTLA4、PD-1蛋白的上调作用。

微囊化共培养诱导骨髓间充质干细胞体外定向成骨分化研究

为了模拟体内成骨微环境,为骨组织工程提供一种调控干细胞体外向成骨细胞定向分化的共培养新方法,SD大鼠骨髓间充质干细胞和包埋在海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-poly-lysine-alginate,APA)微胶囊中的SD大鼠成骨细胞进行体外共培养。共培养过程中,通过碱性磷酸酶(ALP)定量、定性分析以及钙化结节(von Kossa)染色等手段来评价骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化。结果表明在体外微囊化共培养过程中,被诱导细胞的胞内ALP酶活性逐渐高于对照组的干细胞,接近于成骨细胞;ALP以及von Kossa定性染色证实被诱导细胞具有较高的ALP活性以及具有分泌钙基质的能力。微囊化成骨细胞和外部干细胞的共培养体系较好地模拟了体内干细胞向成骨细胞转化的成骨微环境,促进了干细胞向成骨细胞的体外定向分化;微胶囊膜将成骨细胞和干细胞进行了隔离,避免了两者的直接接触和可能的细胞交叉污染混合,同时利于分离目的细胞,这种微囊化共培养体系为骨组织工程提供了一种安全调控干细胞体外成骨定向分化的工程化新方法。

建立体外共培养血脑屏障模型评价纳米粒的胞吞转运和毒性(英文)

目的建立大鼠脑毛细血管内皮细胞(BCECs)和星形胶质细胞共培养模型,评价纳米粒的跨血脑屏障(BBB)转运和对内皮细胞紧密连接的毒性。方法采用复乳/溶媒蒸发法制备载荧光探针6-香豆素的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒。首先,分别从新生鼠大脑分离培养BCECs和星形胶质细胞并进行免疫组化鉴定。然后,将BCECs接种于细胞培养池微孔膜的上面,将星形胶质细胞接种于膜下面建立共培养模型。分别测定14C-蔗糖和纳米粒的渗透系数。结果载6-香豆素纳米粒的平均重均粒径为(102.4±6.8)nm,zeta电位为(-16.81±1.05)mV。BCECs的VIII因子表达呈阳性;星形胶质细胞的胶质原纤维酸性蛋白表达呈阳性。模型的跨内皮细胞电阻值为(313±23)Ω.cm2。扫描电镜和透射电镜观察发现,共培养模型中的BCECs形成紧密连接。纳米粒的质量浓度低于200μg.mL-1时,不影响14C-蔗糖渗透系数的改变,表明其不会影响BBB内皮细胞的紧密连接。10μg.mL-1载6-香豆素纳米粒的渗透系数为0.29×10-3cm.m in-1。结论该大鼠BBB模型与体内情况接近,适合用于评价纳米粒的脑内转运和毒性。

体外共培养双份脐血CD34^+细胞对各自归巢相关分子表达的影响

本研究探讨脐血CD34+细胞体外混合培养对彼此归巢相关分子表达的影响。从正常人骨髓中分离扩增间充质干细胞,富集传代,加速器照射(12Gy)后作为滋养层细胞,将免疫磁珠分选纯化的两份脐血CD34+细胞混合接种到其表面(其中1份CD34+细胞用CFSE标记),观察各自归巢相关分子(黏附分子)表达的变化。结果表明,脐血CD34+细胞分选富集的纯度为(98.25±0.93)%,实验组在共培养6天后,两份脐血CD34+细胞的比例分别降为(60.4±6.32)%和(60.2±5.12)%,但与对照组比较无统计学差异;实验组各份CD34+细胞的CD44,CD62L,CD184以及CD26的阳性率较培养前均无显著变化。而CD162表达显著下降。CD54在培养3天后有所上升,但培养6天后下降至培养前水平,与对照组比较无统计学差异。结论:将两份脐血的CD34+细胞体外混合培养对彼此归巢相关分子并无明显影响。

体外共培养人牙髓干细胞对人牙囊干细胞增殖、成骨分化的作用

目的通过体外建立人牙囊干细胞(human dental follicle stem cells,HDFSCs)和人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)共培养体系,研究HDPSCs对HDFSCs增殖、成骨分化的作用。方法 1利用改良的组织块-消化联合法、免疫组化方法、流式细胞术以及多向诱导方法对HDFSCs和HDPSCs进行分离、培养、鉴定;2采用0.4μm孔径的Transwell小室构建HDFSCs和HDPSCs体外共培养体系;3CCK-8测定HDFSCs增殖活性的变化;4与HDPSCs体外共培养1周,qRTPCR检测HDFSCs几个标志性成骨基因:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、人类相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)以及Ⅰ型胶原(collagen type 1,Col-1)的表达情况。结果 1成功分离、培养、鉴定HDFSCs和HDPSCs;2从第4天开始,共培养组HDFSCs的增殖活力明显高于对照组(P<0.05);3与对照组相比,共培养组ALP、Runx2、OPN、BSP、Col-1的相对表达量均明显增高(P<0.05)。结论与HDPSCs共培养能增强HDFSCs增殖活力及成骨分化。

PHGPx在体外共培养山羊睾丸生精细胞中的定位研究

为探讨磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)在雄性动物生殖机能中的作用及其在体外培养山羊睾丸生精细胞的定位,在已成功构建的山羊睾丸支持细胞-生精细胞共培养的基础上,制作细胞爬片,采用免疫细胞化学技术定位PHGPx的表达。结果显示,PHGPx在支持细胞、精原细胞中不表达,在圆形精子细胞细胞质检测到阳性表达产物。表明PHGPx在精子发生后期圆形精子的变态发育中起特定的调节作用,但作用机制有待深入研究。

CREM在体外共培养山羊睾丸生精细胞中的定位研究

为进一步深入研究CREM基因在雄性动物中的表达调控机制,试验成功建立体外生精细胞和支持细胞共培养体系,并应用免疫细胞化学研究CREM在体外培养山羊睾丸生精细胞的表达特点。结果显示:CREM仅表达于圆形精子细胞,其他生精细胞和支持细胞检测不到CREM的表达。表明CREM基因在圆形精子细胞发育过程中起重要调节作用,但其作用机制有待深入研究。

胚胎体外共培养研究的进展

共培养是模拟早期胚胎在体内发育环境,延长体外发育时间,提高囊胚获得率的方法。因其可提高体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率,特别是提高反复种植失败(IF)者的妊娠率。尽管有不少争议,近年仍有较多与共培养有关的研究,对共培养系统的改进、应用、作用机制的探讨作介绍。

体外直接或间接共培养条件下压力经上皮细胞层对气道平滑肌细胞的影响

通过建立气道上皮细胞与平滑肌细胞体外共培养模型,研究气体压力经上皮细胞对气道平滑肌细胞的作用和机制,为理解真实气道内气体压力作用下气道上皮与平滑肌细胞层之间的信息交流方式及其生理病理效应提供科学依据。首先在体外分别单独培养原代大鼠气道上皮细胞和气道平滑肌细胞,然后以聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜为介质建立气道上皮细胞与气道平滑肌细胞直接或间接的共培养模型,同时利用自制的气体增压装置对共培养模型中的上皮细胞层施加0-6kPa的压力。之后,采用倒置显微镜、MTT法和原子力显微镜(AFM)等观测共培养模型中气道平滑肌细胞在不同压力作用下和不同时间点的形态特征、细胞增殖和杨氏模量。无论在直接和间接共培养模型中,经上皮细胞施加外部压力都导致气道平滑肌细胞形态变宽、变扁,促进细胞增殖和硬化。而且在直接共培养模型下,气道平滑肌细胞对外加压力的响应更为明显。外加压力透过气道上皮细胞确实能够影响气道平滑肌细胞的结构与功能,这种影响很可能随着上皮细胞和平滑肌细胞间的距离靠近而增强。这一发现对于揭示不同细胞之间的力学信号传导方式有重要的意义,特别是有助于理解哮喘病中气道上皮细胞挤压与气道平滑肌细胞病理变化的关系及其在哮喘病理机制中的作用。

体外共培养条件下种植窗期子宫内膜与胚胎的相互作用

目的:探讨体外共培养条件下种植窗期子宫内膜与胚胎的相互作用。方法:选择2014年6月至2015年6月在郑州大学第二附属医院生殖中心取卵后因有卵巢过度刺激综合征倾向取消移植的20例患者,于取卵后第3天取其子宫内膜,和胚胎组成共培养组(A组),以单独内膜组(B组)和单独胚胎组(C组)作为对照组,采用RT-PCR法分别于(取卵后)第3、4、5、6、7天检测共培养组和单独内膜组LIF m RNA和IGF m RNA的表达水平,并在显微镜下观察共培养组和单独胚胎组的胚胎生长情况。结果:共培养组LIF m RNA和IGF m RNA表达要高于单独内膜组,且在种植窗期达到最高,差异有统计学意义(P<0.05)。共培养组胚胎生长发育要优于单独胚胎组。结论:共培养对胚胎发育有积极的支持作用,使子宫内膜容受性提高,同时提高胚胎质量,要优于单独培养。

神经干细胞与脊髓脱细胞支架体外共培养的可行性

目的观察大鼠神经干细胞(NSCs)在脊髓脱细胞支架(SCAS)上黏附、生长和分化情况,评价其构建脊髓组织工程的可行性。方法新生Sprague-Dawley大鼠大脑皮质来源NSCs传代培养并鉴定;Sprague-Dawley雌性大鼠脊髓组织改良物理振荡结合化学萃取法制备SCAS,并行基础评估;将第三代NSCs种植在SCAS上,体外共培养,免疫荧光、免疫组化和扫描电镜观察支架上细胞形态。结果共培养的细胞为能增殖、分化的NSCs。制备的SCAS孔隙率、含水率、酶解率都明显高于正常脊髓(|t|>4.679,P<0.01);SCAS基质结构呈疏松网络状,基质上可见极少量残留细胞核。NSCs在SCAS上黏附、生长良好,可分化为神经元和神经胶质细胞。结论制备的SCAS脱细胞较彻底,具有多通道空间结构,适合NSCs黏附、生长和分化,可用于脊髓组织工程。