绵羊ApoER2基因克隆及其干扰质粒对睾丸共培养细胞硒蛋白表达的影响

本研究旨在克隆绵羊ApoER2基因,构建ApoER2-siRNA质粒载体,研究ApoER2基因沉默对睾丸共培养细胞SelP和PHGPx表达的影响。利用RT-PCR技术,克隆ApoER2序列,在此基础上构建4种pGPU6/GFP/Neo—ApoER2-siRNA质粒表达载体,利用脂质体将其转染到体外共培养绵羊睾丸细胞中,采用Real—time PCR和Western blotting方法,检测其抑制效应,并研究ApoER2基因沉默对Sel P和PHGPx mRNA表达的影响。本研究成功获得了长度为2 490 bp的绵羊睾丸ApoER2完整编码区序列,共编码892个氨基酸,绵羊ApoER2核苷酸序列与牛的同源性最高,相似性为97.7%。ApoER2-siRNA-1565和ApoER2-siRNA-2567位点重组质粒的干扰效果较好(P<0.01),选取ApoER2-siRNA-2567重组质粒,结果显示转染组Sel P和PHGPx表达量显著降低(P<0.01)。获得了绵羊ApoER2编码区序列和有效抑制该基因表达的2个质粒载体,ApoER2沉默可能影响了睾丸硒蛋白Sel P和PHGPx的表达,为进一步研究ApoER2转运硒机理提供了理论依据。

细胞体外共培养模型在中枢神经系统疾病的应用研究进展

细胞间的通讯是正常生理学中不可缺少的活动,但单细胞体外培养模型不能很好地反映人体复杂的细胞通讯活动。细胞体外共培养模型可以通过模拟体内环境,观察不同细胞与细胞之间,以及细胞与胞外环境之间的相互作用,广泛应用于神经退行性疾病的研究。神经炎症引起的神经元损伤与神经退行性疾病发生机制的关系目前尚未完全明确。细胞体外共培养模型可以用于研究特定的炎症分子途径,直观了解大脑细胞之间复杂的相互作用,从而进一步揭示神经细胞与神经胶质细胞之间的串扰机制。本文对不同细胞体外共培养模型在中枢神经系统疾病中的应用研究进行综述,以期为中枢神经系统疾病的基础研究提供参考。

牙髓再生组织工程中的细胞共培养体系

背景:常规根管治疗去除所有牙髓组织会导致牙的生理功能和组织再生能力丧失,体外培养牙髓干细胞并使之形成牙髓样组织,再移植入髓腔内成为了理想的牙髓再生治疗方法。目的:汇总阐述通过共培养体系诱导牙髓干细胞形成牙髓样组织的研究进展,为牙髓组织再生的干细胞治疗方法提供思路。方法:第一作者于PubMed、中国知网和万方数据库检索时限为2022年5月以前发表的相关文献。英文检索词为“dental pulp regeneration,dental pulp stem cell,co-culture,tissue engineering,signaling pathway”,中文检索词为“牙髓再生、牙髓干细胞、共培养、组织工程、支架、信号通路”,纳入67篇符合标准的文献进行总结阐述。结果与结论:①共培养体系由细胞主体和组合细胞通过不同的组合方式构成。②现阶段共培养体系组合方式可分为直接共培养与间接共培养2种,生物支架材料的介入、培养条件的改变等作用又可将共培养结局分为二维和三维再生组织。③直接共培养通过细胞间接触构建生理性的细胞外基质以及利于干细胞增殖分化的微环境。④间接共培养解决了组合细胞来源不足、不同个体间免疫排异反应等问题,组合细胞产生的生物因子更易制成临床使用的药物和生物支架材料。⑤目前共培养体系在成血管有优越表现,但其他结构相关报道较少,且共培养结局形成的再生组织仍具有不确定性。同时,由于牙体解剖结构、排异反应等限制因素,将共培养体系生成的再生组织运用于临床仍然困难。

左金丸对IEC6、HCT116细胞共培养模型肠上皮屏障功能的保护及机制研究

目的 研究左金丸对IEC6、HCT116细胞共培养模型肠上皮屏障功能的影响,并初步探讨其作用机制。方法 采用左金丸醇提物低、中、高剂量(5、10、20μg·mL^(-1))处理HCT116、IEC6细胞,采用MTT法检测细胞增殖情况。通过体外构建IEC6、HCT116细胞共培养体系模拟结肠癌微环境,以左金丸(5、10、20μg·mL^(-1))进行干预;检测IEC6细胞跨膜电阻(TEER)值及细胞通透性;采用高效液相色谱(HPLC)法检测HCT116、IEC6细胞多胺含量;微量法检测HCT116细胞的葡萄糖消耗量、乳酸及ATP含量;Western Blot法检测IEC6细胞Zonula occluden 1(ZO-1)、Occludin蛋白和HCT116细胞鸟氨酸脱羧酶(ODC)、精眯/精胺N1-乙酰基转移酶(SSAT)、鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)、SLC22A1、缺氧诱导因子1(HIF1α)、C-Myc、己糖激酶2(HK2)、丙酮酸激酶M2亚型(PKM2)、丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)、葡萄糖转运体1(GLUT1)、乳酸脱氢酶(LDHA)蛋白表达情况。结果 (1)与对照组比较,左金丸低、中、高剂量(5、10、20μg·mL^(-1))处理HCT116细胞24、48、72 h后,细胞增殖抑制率显著升高(P<0.01);左金丸低、中、高剂量(5、10、20μg·mL^(-1))处理IEC6细胞24 h后,细胞增殖抑制率无明显变化(P>0.05)。(2)与IEC6细胞单培养组比较,共培养模型组细胞的TEER及FD4荧光强度显著降低(P<0.01);紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达量显著降低(P<0.01);IEC6细胞的多胺含量显著降低(P<0.01)。与HCT116细胞单培养组比较,共培养模型组HCT116细胞的多胺含量显著增加(P<0.01)。与共培养模型组比较,左金丸中、高剂量组细胞的TEER及FD4荧光强度显著升高(P<0.01);左金丸高剂量组IEC6细胞ZO-1、Occludin蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01);左金丸低、中、高剂量组的IEC6细胞多胺含量显著增加(P<0.01),而左金丸中、高剂量组HCT116细胞的多胺含量显著降低(P<0.01)。(3)与对照组比较,左金丸能明显下调HCT116细胞多胺合成酶ODC、多胺转运体SLC22A1蛋白的表达(P<0.05,P<0.01),明显上调SSAT、OAZ1蛋白表达(P<0.05,P<0.01);能够明显抑制HCT116细胞的葡萄糖消耗量、乳酸生产量及ATP含量(P<0.05,P<0.01);明显下调糖酵解通路HIF1α、C-Myc、HK2、PKM2、PDK1、GLUT1、LDHA蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论 左金丸对IEC6、HCT116细胞共培养模型肠上皮屏障功能具有保护作用,对结肠癌HCT116细胞具有增殖抑制作用,可能与其调节HCT116细胞多胺代谢、转运以及抑制肿瘤糖酵解水平有关。

树突状细胞与同源细胞因子诱导的杀伤细胞共培养细胞在肿瘤免疫治疗中的作用

目的 观察树突状细胞 (DC)与同源细胞因子诱导的杀伤 (CIK)细胞共培养后 ,共培养细胞 (DC CIK细胞 )的表型、体外增殖活性和细胞毒活性的变化 ,并探讨CIK细胞在肿瘤治疗中的作用。方法 (1)提取 3名健康献血者的外周血单个核细胞 (PBMC) ,常规诱导出DC与CIK细胞后 ,将其共培养 ,动态观察CIK细胞和DC CIK细胞增殖活性和表型变化 ;并用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法测定其体外细胞毒活性 ;(2 ) 80只BALB/c裸鼠随机分为 2组 ,分别在前肢腋下接种A5 4 9肺腺癌细胞和BEL 74 0 4肝癌细胞。 10d后分别选择荷A5 4 9和BEL 74 0 4瘤大小相似的裸鼠各 30只 ,全部一次性腹腔注射化疗药物后 ,每组再随机分成 3组。①单独化疗组 ;②CIK治疗组 ;③DC CIK治疗组 ,每组 10只。单独化疗组注射化疗药物后不再进行任何处理 ,另 2组分别于化疗后的第 2、4、6、8、10天腹腔注射CIK细胞和DC CIK细胞进行免疫治疗。结果 (1)经DC作用后的CIK细胞CD+ 3 CD+ 56双阳性细胞和CD+ 8细胞的数量明显升高 ;(2 )DC CIK细胞的增殖速度明显快于同源CIK细胞 ,DC CIK细胞的细胞毒活性远高于CIK细胞 ;(3)在肿瘤的治疗中 ,CIK细胞可提高化疗的效果。化疗后 2 5d ,CIK治疗组和DC CIK治疗组肿瘤受抑制的程度均明显大于单独化疗组 ,DC CIK组大于CIK治?

骨髓间充质干细胞共培养对肝星状细胞增殖、凋亡和RohA表达的调控

目的:观察体外大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养对肝星状细胞(HSCs)增殖、凋亡和RohA表达的影响,探讨BMSCs旁分泌HGF在其中的作用机制.方法:贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠BMSCs,传代至第4代使用;大鼠肝星状细胞(HSC-T6)系及纤维原细胞系冻融后传代使用.应用6孔塑料细胞培养盒,每孔使用半透膜(transwell insert)建立上下双层细胞共培养体系,常规培养.实验分4组:空白对照组、阴性对照组、BMSCs实验组、预处理实验组(c-met多克隆抗体预处理).用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测HSCs细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞凋亡;RT-PCR、Westernblot检测BMSCs与HSCs共培养后HSCs内RohAmRNA和蛋白的表达.酶联免疫吸附法(ELISA)检测BMSCs与HSCs共培养上清液中肝细胞生长因子(HGF)浓度.结果:BMSCs对HSCs增殖具有抑制作用,BMSCs与HSCs共培养后24h、48h的增殖抑制率分别为12.21%,35.43%,与空白对照组、实验对照组和C-met抗体预处理组比较有显著性差异(P<0.01).Annexin-V-FITC/PI双染法检测BMSCs与HSCs共培养48h后HSCs的凋亡率为25.80%,与空白对照组、实验对照组与c-met抗体预处理组比较有显著性差异(P<0.01).BMSCs与HSCs共培养48h,BMSCs组RohAmRNA的表达抑制明显,且显著低于空白对照组、实验对照组与C-met抗体预处理组,有显著性差异(P<0.01).BMSCs与HSCs共培养48hRohA蛋白的表达明显抑制,且显著低于空白对照组、实验对照组与C-met抗体预处理组,有显著性差异(P<0.01).ELISA检测BMSCs与HSCs共培养24h、48h上清液中HGF浓度分别为250ng/L与570ng/L,明显高于单独BMSCs培养和单独HSCs培养,有显著性差异(P<0.01).结论:BMSCs与HSCs共培养能抑制HSCs的增殖,促进凋亡,抑制RohA表达,其机制可能是通过BMSCs旁分泌HGF发挥抑制大鼠HSCs增殖,促进凋亡的作用.

聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米粒在Caco-2/HT29-MTX共培养细胞模型的转运研究

建立Caco-2/HT29-MTX共培养细胞模型,研究不同表面化学性质的PLGA纳米粒在覆盖黏液层的Caco-2/HT29-MTX共培养细胞模型的转运能力。以聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体材料,通过单甲氧基聚乙二醇(mPEG)及壳聚糖(chitosan)对其进行表面修饰,采用纳米沉淀法制备PLGA-NPs、mPEG-PLGA-NPs和壳聚糖包裹的PLGA-NPs,并测定其平均粒径及zeta电位。以香豆素-6(coumarin 6)为荧光标记物,通过激光共聚焦显微镜观察纳米粒的转运情况;以呋喃二烯(FDE)为模型药物,HPLC测定纳米粒的转运量。通过加入内吞阻断剂秋水仙素及诺可唑研究纳米粒的转运机制。采用免疫荧光法考察不同表面化学性质的纳米粒对细胞紧密连接蛋白ZO-1的影响。结果表明,纳米粒分散均匀,PLGA-NPs表面荷负电,经mPEG修饰后zeta电位近电中性,壳聚糖包裹后表面荷正电。呋喃二烯的包封率均>75%。mPEG-PLGA-NPs在Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的转运能力高于PLGA-NPs和CS-PLGA-NPs,在秋水仙素及诺可唑作用下转运量明显降低,并影响ZO-1蛋白的分布。说明PLGA-NPs和mPEG-PLGA-NPs可能通过胞吞作用和细胞旁路途径进行转运,CS-PLGA-NPs主要以胞吞作用进行转运;mPEG-PLGA-NPs因其表面的亲水性及电荷近中性,具有较好的抗黏性能,能够快速穿过黏液层到达细胞并转运。

黄芪甲苷对Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜及软骨细胞共培养体系相关因子的调控作用

目的观察黄芪甲苷对Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞和人软骨细胞共培养体系相关因子的调控作用,初步阐释黄芪甲苷治疗骨关节炎的分子作用机制。方法通过β-catenin慢病毒载体转染正常人滑膜细胞,激活其Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞与正常人软骨细胞置于Transwell小室中共培养。黄芪甲苷混悬液干预共培养体系,采用ELISA方法检测黄芪甲苷对滑膜细胞、软骨细胞培养上清液基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、Ⅱ型胶原羧基端肽(CTX-Ⅱ)、软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达的影响。结果黄芪甲苷干预后,ELISA法检测发现滑膜与软骨细胞上清液中MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP表达与正常对照相比明显升高(P<0.01)。结论黄芪甲苷可以抑制滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路,下调MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的表达。黄芪甲苷可能通过抑制骨关节炎滑膜Wnt/β-catenin信号通路,改善滑膜炎症、调控滑膜-软骨共同体系微环境、达到抑制软骨降解,促进软骨细胞功能恢复而治疗骨关节炎。

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外构建软骨的初步研究

目的 探讨不同浓度软骨细胞提供的软骨微环境诱导骨髓基质干细胞(BMSC)体外构建软骨的可行性。方法 将体外分别培养扩增的猪BMSC与耳软骨细胞按不同比例混合(9:1,8:2),均以5.0×107/mL的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种作为阳性及阴性对照,以20％上述浓度的单纯软骨细胞接种作为低软骨细胞浓度对照。各标本于体外培养4周时取材,通过大体观察、组织学以及免疫组化等方法对新生软骨进行初步评价。结果 各组细胞均与材料粘附良好。8:2共培养组及阳性对照组在体外培养4周时,外观已类似软骨组织并基本保持了材料的大小和形状,组织学显示有较连续的成熟软骨形成,免疫组化也均显示有大量Ⅱ型胶原分泌。9:1共培养组在培养过程中稍有缩小和变形,组织学上仅在培养物的边缘可见到连续的软骨样组织。阴性对照组明显皱缩变形,组织学未见成熟软骨陷窝。低软骨细胞浓度组复合物明显变薄,只在局部形成了不连续的软骨组织,新生软骨量明显少于共培养各组及阳性对照组。结论软骨细胞能够提供软骨微环境诱导BMSC成软骨分化并形成软骨,20％浓度的软骨细胞已能够达到良好的诱导效果。

塞来昔布对人滑膜细胞和人软骨细胞共培养体系相关因子的调控作用

目的观察塞来昔布对Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞和人软骨细胞共培养体系相关因子的调控作用,初步阐释塞来昔布治疗骨关节炎的分子作用机制。方法通过β-catenin慢病毒载体转染正常人滑膜细胞,激活其Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞与正常人软骨细胞置于Transwell小室中共培养。倒置显微镜观察Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对人软骨细胞形态学变化的影响。塞来昔布混悬液干预共培养体系,采用Western blot方法检测塞来昔布对滑膜细胞β-catenin蛋白表达的影响;采用ELISA方法检测塞来昔布对滑膜细胞、软骨细胞培养上清液基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、Ⅱ型胶原羧基端肽(CTX-Ⅱ)、软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达的影响。结果β-catenin慢病毒载体转染正常人滑膜细胞后成功激活Wnt信号通路并与软骨细胞共培养。随着培养时间的延长,软骨细胞生长逐渐受到抑制,软骨细胞胞体边缘与板壁接触处发白,折光度增加,细胞贴壁强度降低。塞来昔布干预后,Western blot检测发现滑膜细胞中β-catenin蛋白的表达明显下调(P<0.01);ELISA法检测发现滑膜与软骨细胞上清液中MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的表达与正常对照相比明显升高(P<0.01)。结论滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活可以使软骨细胞生长受到抑制。塞来昔布可以降低滑膜细胞β-catenin表达,且与干预时间长短相关。塞来昔布可以抑制滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路,下调MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的表达。塞来昔布可能通过抑制OA滑膜Wnt/β-catenin信号通路,改善滑膜炎症、调控滑膜-软骨共同体系微环境、达到抑制软骨降解,促进软骨细胞功能恢复而治疗骨关节炎。

黄芪甲苷对Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞和人软骨细胞共培养体系MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的调控作用

目的观察黄芪甲苷对Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞和人软骨细胞共培养体系基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、Ⅱ型胶原羧基端肽(CTX-Ⅱ)、软骨寡聚基质蛋白(COMP)的调控作用,初步阐释黄芪甲苷治疗骨关节炎的分子作用机制。方法通过β-catenin慢病毒载体转染正常人滑膜细胞,激活其Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞与正常人软骨细胞置于Transwell小室中共培养。倒置显微镜观察Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对人软骨细胞形态学变化的影响。黄芪甲苷混悬液干预共培养体系,采用Western bolt方法检测黄芪甲苷对滑膜细胞β-catenin蛋白表达的影响;采用ELISA方法检测黄芪甲苷对滑膜细胞、软骨细胞培养上清液MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP表达的影响。结果β-catenin慢病毒载体转染正常人滑膜细胞后成功激活Wnt信号通路并与软骨细胞共培养。随培养时间的延长,软骨细胞生长逐渐受到抑制,软骨细胞胞体边缘与板壁接触处发白,折光度增加,细胞贴壁强度降低。黄芪甲苷干预后,Western blot检测发现滑膜细胞中β-catenin蛋白的表达明显下调(P<0.01);ELISA法检测发现滑膜与软骨细胞上清液中MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP表达与正常对照相比明显升高(P<0.01)。结论滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活可以使软骨细胞生长受到抑制。黄芪甲苷可以降低滑膜细胞β-catenin表达,且与干预时间长短相关。黄芪甲苷可以抑制滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路,下调MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的表达。黄芪甲苷可能通过抑制OA滑膜Wnt/β-catenin信号通路,改善滑膜炎症、调控滑膜-软骨共同体系微环境、达到抑制软骨降解,促进软骨细胞功能恢复而治疗骨关节炎。

离体细胞共培养中科间细胞共质体的形成

离体培养下选出的绿色胡萝卜（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）细胞系和白色普通烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ ）细胞系，各自具有独特的细胞结构标志，在愈伤组织、光镜和电镜３ 个水平上均可区分。对两个细胞系进行分散、混合、Ｋ＋ 液低渗处理后在固体培养基上共培养，１０—１５ ｄ 后可观察到两种细胞的镶嵌生长。光镜和电镜下均观察到烟草细胞和胡萝卜细胞之间隔离层的存在与消失。在隔离层消失的区域可见到异种细胞间次生胞间连丝的形成，从而将独立的两个共质体连成一个统一的共质体。对科间细胞共质联系的建立过程进行了讨论，认为细胞接触后首先非特异粘连——以隔离层形成并适度加厚为标志，然后特异的细胞识别在隔离层中启动，从而导致隔离层或消失而重新建立共质联系或加厚、木质化。

共培养体系下小鼠巨噬细胞RAW264.7与骨骼肌细胞C2C12间的相互作用

目的建立巨噬细胞RAW264.7和成肌细胞C2C12共培养体系,检测该共培养体系下培养不同时长RAW264.7和C2C12间的相互作用。方法 Transwell小室内以成肌分化培养基共培养RAW264. 7和C2C12,相差显微镜观察细胞形态,共培养1、3、5 d后,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western blot法检测Myf5、MyoD、myogenin、iNOS和Arg-1蛋白水平,ELISA法检测培养细胞上清液IL-1β和IL-10分泌量。结果①共培养对C2C12的影响:加快成肌分化进程、促进多核肌管形成,与同时间点对照组相比,共培养1 d即抑制Myf5蛋白表达(P<0.05),增加MyoD(P<0.05)和myogenin(P<0.01)蛋白表达;共培养3 d抑制Myf5蛋白表达(P<0.01),增加MyoD蛋白表达(P<0.01);共培养5 d降低细胞活性(P<0.05)并降低Myf5蛋白表达(P<0.01),增加肌管面积(P<0.01)。②共培养对RAW264.7的影响:共培养对细胞形态无明显影响,与同时间点对照组相比,共培养1 d抑制iNOS蛋白表达(P<0.01)和IL-1β分泌(P<0.05),增加Arg-1蛋白表达(P<0.01);共培养3 d抑制iNOS蛋白表达和IL-1β分泌(P<0.01),增加Arg-1蛋白表达(P<0.01)和IL-10分泌(P<0.05);共培养5 d细胞簇集更加明显,促进细胞增殖(P<0.05),抑制iNOS蛋白表达和IL-1β分泌(P<0.01),增加IL-10分泌(P<0.05)。结论 C2C12和RAW264.7共培养促进成肌细胞的成肌分化以及巨噬细胞的增殖和M2型极化。

脱细胞软骨生物支架材料与大鼠骨髓间充质干细胞共培养及体内埋植后的降解

背景：动物体内埋植实验被认为是最常用有效的检测生物相容性的方法。目的：拟观察脱细胞软骨生物支架材料与细胞共培养及体内埋植实验时的生物降解性。时间及地点：观察性实验,于2007-06/08在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。材料：SD大鼠,体质量60-80g;6月龄猪由山西畜牧研究所提供。方法：①分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取猪膝关节软骨制备脱细胞关节软骨支架材料,将两者进行复合培养。未经与无细胞胶原基质联合培养的细胞作为正常对照。②将备好的生物支架材料植入大鼠背部皮下,于14,28d取材,对其进行大体及组织染色。主要观察指标：①对复合细胞的无细胞胶原基质进行石蜡切片常规染色,倒置显微镜下观察24,72h细胞与无细胞胶原基质共培养情况。②通过炎性细胞反应及纤维囊形成级别评定标准、材料降解结果评定合格标准分析植入材料在动物体内降解情况。结果：①倒置显微镜下观察与无细胞胶原基质共培养24h细胞多呈长梭形和多角形;72h后与无细胞胶原基质联合培养和未与无细胞胶原基质联合培养的2种细胞形态相似,均呈多角形和圆锥形。苏木精-伊红染色可见细胞嵌入软骨支架材料中,呈圆形和椭圆形,部分细胞可见细胞核,材料呈颗粒状,染色均一。②组织学观察可见试样周围存在少量淋巴细胞和嗜中性粒细胞,致密纤维囊壁将复合细胞的材料包裹,材料被降解为细小颗粒,细胞均匀散在材料中呈椭圆形,可见分裂相。结论：支架材料在与细胞共培养及体内埋植实验中均生长正常,经过4周材料顺利降解为细小颗粒。

大鼠骨髓间充质干细胞与脱细胞脊髓支架体外共培养

目的评价脱细胞脊髓支架在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养中的作用,探索最佳接种浓度。方法分离、培养及鉴定SD大鼠BMSCs,诱导BMSCs向神经元样细胞分化。制备脱细胞脊髓支架,将第3代BMSCs同脱细胞脊髓支架共培养,MTT法检测细胞增殖活性,比较与普通培养的差异;取第3代BMSCs以不同浓度[(0.5、1、2、3、4)×106/mL]接种于支架(脊髓支架修整0.5cm小段),检测细胞在支架上的粘附率及上架细胞数,建立接种浓度与细胞粘附率、上架细胞数的关系回归方程;扫描电镜观察脱细胞脊髓支架形态以及细胞与支架的粘附情况。结果成功实现BMSCs的分离及培养,BMSCs流式鉴定CD29、CD90阳性表达,向神经元诱导胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)呈阳性表达;与普通培养相比,BMSCs在支架上细胞增殖活力显著提高(P<0.05);细胞与支架的粘附率在接种浓度为2×106/mL最高,达到(79.6±2.7)%,单位体积上架细胞数达到(1.364±0.047)×106/cm3;扫描电镜观察支架空间结构良好,细胞与支架粘附良好,共培养第3天较第1天细胞数量明显增加。结论脱细胞脊髓支架具有多通道的空间结构,适合BMSCs粘附、存活、增殖,该支架是良好的天然脊髓组织工程材料。当粘附率及细胞上架数基本达到最大时的最佳接种浓度为2×106/mL。

体外细胞组织重建中共培养技术的应用

细胞共培养体系在维持细胞基本结构和性状的基础上,通过两种或多种细胞组织的相互作用,使体内外环境尽可能相吻合,弥补了单层细胞培养的缺陷,有利于构建更加接近生理状态的重建体外细胞组织,被广泛应用于现代细胞研究,成为角膜、牙周、软骨、心血管以及神经细胞组织等体外构建的重要技术应用。在干细胞研究中,多孔膜两侧直接接触共培养日益受到重视,三维细胞共培养将是未来发展的方向。

睫状缘色素细胞与骨髓间充质干细胞体外共培养构建视网膜干细胞的初步研究

目的探索睫状缘色素细胞(pigmented cells from the ciliary margin,PCM)与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM)体外共培养构建视网膜干细胞的可行性。方法按照组织贴壁培养方法分别分离培养原代大鼠BM和PCM,再将二者进行直接共培养(1∶2),观察细胞生长情况;MTT方法进行增殖能力检测;在促神经分化诱导液中诱导21 d后行免疫荧光染色,观察视网膜干细胞相关分子标记物包括视杆细胞Rho1D4、双极神经元CHX10和Müller胶质细胞10E4的表达。结果原代分离培养的两种细胞生长状态良好;共培养后细胞总体的增殖活性虽然显著低于单纯BM,但比单纯PCM有了一定提升;诱导分化后单纯PCM视网膜干细胞相关分子标记物表达阳性率显著高于BM,而共培养后的细胞表达阳性率显著高于单纯PCM和BM。结论采用BM与PCM共培养能够获得大量表达视网膜干细胞相关分子标记物的细胞群,有望成为视网膜干细胞来源,用于视神经损伤修复。

GUS基因转入烟草细胞通过科间细胞共培养在胡萝卜再生植株中的表达

用Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４（含有质粒ｐＢＩ１２１和ｐＡＬ４４０４）介导转化普通烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）的悬浮细胞，获得卡那霉素抗性（ＫｍＲ）材料，其再生植株中表现ＧＵＳ活性。以这一继代半年以上的转基因烟草细胞系为材料，与胡萝卜（Ｄａｕｃｕｓｃａｒｏｔａ）细胞进行科间细胞共培养和低渗活化等处理，在含２００ｍｇ·ｌ－１卡那霉素（Ｋｍ）的培养基上筛选，得到具有ＫｍＲ的胡萝卜田胞系（ｃｅＲ），其再生的胡萝卜植株中也有一部分表现为ＫｍＲ，并在部分植株中检测到ＧＵＳ活性。这一结果表明Ｔ—ＤＮＡ可以通过科间细胞的共培养而从转基因烟草细胞中通过胞间通道转移到胡萝卜细胞中，并在胡萝卜细胞中表达。从这一结果来看，细胞共培养和有关处理的技术（ＡＣＨＴ）可能会成为植物基因转移的新技术。同时，发现共培养可以改进原来不亲和细胞之间的亲和性，这为植物细胞的识别和亲和性研究、亲和性的改善提供了方法和技术。

细胞共培养技术在美白药物研究中的应用及前景

随着生活水平的提高,人们对生活质量的要求越来越高,越来越重视皮肤的自然美白。运用细胞培养技术从中药中寻找安全、有效的脱色剂已成为研究的主要方向。目前,所用的细胞实验模型有一种细胞的单独培养、两种或两种以上细胞的共培养。单独培养一种细胞未考虑体内其他细胞对其产生的作用,而细胞共培养弥补了这方面的不足,让研究者能够使用更符合生理学特点的模型来进行一系列研究。本文就细胞共培养技术筛选美白药物的发展现状及前景综述如下。

曲细精管片段培养法和混合细胞共培养法对小鼠生精细胞的增殖分化效应

目的：探讨曲细精管片段培养法和混合细胞共培养法对体外培养生精细胞的增殖、分化效应。方法采用曲细精管片段培养法和生精细胞-支持细胞共培养法对7～8d小鼠生精细胞进行体外培养，通过细胞形态学观察、细胞存活率和精母细胞特异性基因P19、单倍体精子细胞特异性基因TP1检测及染色体倍性分析，比较两种培养法生精细胞的存活、增殖以及分化情况。结果两种培养方法均可见生精细胞增殖，P19／TP1比值呈降低趋势，并可获得少量带鞭毛的精子细胞和长形精子，但共培养法生精细胞增殖速度及存活时间均优于片段法。体外培养各阶段，共培养法所获细胞数和存活率及单倍体精子细胞形成率均显著高于片段培养法（P＜0．05）；P19／TP1比值显著低于组织片段培养法（P＜0．05）。结论生精细胞-支持细胞共培养法的细胞增殖速度、存活率、存活时间及单倍体精子细胞形成率均优于曲细精管片段培养法，是较为理想的小鼠生精细胞体外培养方法。