共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应在呼吸道副黏病毒科病毒诊断中的应用

采用共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应(CODEHOP PCR)体系和商品化RV12试剂盒对急性呼吸道感染患儿下呼吸道标本中的副黏病毒科病毒进行检测,比较CODEHOP PCR与RV12试剂盒检测结果的符合率和敏感度,观察CODEHOP PCR在临床呼吸道标本中对副黏病毒诊断的应用价值,进一步探讨具备检测已知呼吸道病毒和未知新病毒特点的CODEHOP PCR在呼吸道疾病谱和未知潜在呼吸道病毒诊断中的推广价值。采集2011年上海市儿童医院因急性呼吸道感染住院的患儿下呼吸道标本572份,分别采用2种方法对副黏病毒进行检测。CODEHOP PCR检测出阳性标本113例,阳性率为19.76%;RV12试剂盒检测出阳性标本102例,阳性率17.83%;2种方法检测符合率为85.39%。以10倍倍比稀释呼吸道合胞病毒A(RSVA)感染的细胞收获液,检测结果显示,CODEHOP PCR和RV12试剂盒检测下限分别为10-8和10-6。CODEHOP PCR具备简便、易操作和测序精度高等特点,适合疾病预防系统和临床检验科使用。该方法与一些新兴的高通量快速分子诊断技术结合,可提高检测灵敏度,具有高通量、快速检测和筛查未知新病毒的优势,在呼吸道病原体检测领域值得进一步优化和推广。

沙粒病毒属四步法一致-简并杂合寡核苷酸引物实时荧光PCR检测体系的建立

目的建立沙粒病毒属四步法一致-简并杂合寡核苷酸引物（CODEHOP）实时荧光PCR（Real-time PCR）检测体系。方法设计1对沙粒病毒属的一致-简并引物,分析Real-time PCR的扩增曲线和熔解曲线,根据引物二聚体（PDs）和扩增产物的熔解温度（Tm）值,在通用的三步法延伸步骤之后,增加5 s的恒温荧光检测步骤,在PDs和特异性扩增产物的熔解温度之间进行荧光检测温度的优化,建立四步法CODEHOP Real-time PCR方法,评价其灵敏度、特异性和重复性。结果 PDs的Tm值为75.32-76.86℃,特异性扩增产物的Tm值为86.84℃,增加一步温度为84℃,荧光检测步骤可有效去除PDs对检测结果的影响,该方法特异性为100%,病毒RNA检测灵敏度为59.6 pg,重复性良好,变异系数〈5%,12份鼠肺盲样的检测结果符合预期。结论建立的沙粒病毒四步法CODEHOP Real-time PCR检测方法敏感、特异,可用于鼠类沙粒病毒感染检测。

简并PCR在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR(CODEHOP-PCR)在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段,经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序,与Genbank提供的序列比较,确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明,所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上,其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定,与传统的病毒分离及血清中和试验相比,具有更快速、准确的优点。

巴斯德杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立巴斯德杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为实验动物的呼吸道细菌的控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对Genbank中13株巴斯德杆菌的RNA聚合酶β亚基(rpo B)氨基酸序列设计简并引物。对建立CODEHOP PCR方法用21株参考菌株进行特异性和敏感性评价,并应用于实验动物中的巴斯德杆菌检测。结果简并引物Past F6/PastR5扩增标准菌株的目的片段为200 bp左右。能够区分受试的巴斯德杆菌和主要的实验动物呼吸道病原菌。敏感性为0.2 pg/μL^2 pg/μL。在受试的609只实验动物中呼吸道样品中检测出巴斯德杆菌阳性率为19.1%。样品阳性片段经测序验证,准确率为100%。结论所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,可用于动物样品中巴斯德杆菌的检测。

基于CODEHOP的欧李钙调蛋白基因片段的克隆

为克隆欧李钙调蛋白基因序列,本研究采用CODEHOP方法设计了一对简并引物,F1:5'-GGCTGACCAACTGACCga(c/t)ga(c/t)ca(a/g)at-3';F2:5'-CACGTCAGCCTCTCTGatcat(c/t)tc(a/g)tc-3';并采用传统简并引物设计方法设计了简并引物N1:5’-AAATGGC(A/C/G)GATCAGCT(A/C/T)AC-3’;N2:5:’-CACTT(A/G)GCCATCATGAC(C/T)TT-3’.从欧李的幼苗组织中成功克隆出了钙调蛋白基因片段,并第一次完成了对该序列的测序.通过利用NCBI的Blast进行分析等方法证实了该序列与其他植物的钙调蛋白序列具有高度的同源性,该序列与梅花、桃、甜樱桃的钙调蛋白序列同源性都在90%以上.研究证明CODEHOP软件相比传统的设计简并引物的方法具有可信性和高效性,并且钙调蛋白目的基因的成功克隆对钙调蛋白以及欧李高钙特性的研究提供了基础数据.

蚊类携带甲病毒属病毒CODEHOP RT-PCR检测方法的建立

目的建立蚊类感染甲病毒属病毒的CODEHOPRT—PCR检测方法。方法依据甲病毒属病毒非结构蛋白氨基酸序列，设计1对CODEHOP引物，建立甲病毒属病毒一步RT—PCR检测方法，分析该引物在对不同种甲病毒基因序列上的结合位点及所能获得的产物序列大小；通过检测甲病毒属基孔肯亚病毒JC2012株，评价该方法的特异性和灵敏度：对JC2012扩增产物进行Blast同源性比对。结果建立的CODEHOPRT-PCR方法可特异性扩增基孔肯亚病毒核酸，目的片段的大小与预期结果相符，核酸的最小检出量为56．7pg。经Blast比对，结果与Genebank公布的CHIKVJC2012序列结果一致。同时从GenBank获得的22种甲病毒均存在CODEHOP引物结合位点．扩增产物大小在510～550bp之间。结论建立的甲病毒CODEHOPRT—PCR检测方法敏感、特异，可用于蚊类甲病毒感染检测。

应用CODEHOP PCR快速检测水体中致病性弧菌

目的建立可以快速检测不同致病性弧菌的CODEHOP PCR方法。方法以致病性弧菌共有的DNA旋转酶B亚单位氨基酸为目标,采用CODEHOP程序,设计一对引物,建立弧菌CODEHOP PCR检测方法,以8种不同致病性弧菌菌株及其他菌株为模板,评价方法的灵敏度、特异性,并对64份入境船舶压舱水进行致病弧菌检测。结果该方法特异性好,8种致病性弧菌标准菌株均获得特异性扩增条带,检测灵敏度可以达到3×103CFU/ml,从64份入境压舱水中检测到14份阳性样品,PCR产物经TA克隆后,测序分析确定为4种不同致病性弧菌。结论本研究所建立的方法可用于致病性弧菌的快速检测与种类鉴定。