共济失调性毛细血管扩张症突变基因mRNA在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨共济失调性毛细血管扩张症突变基因(ATM)mRNA在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法:用原位分子杂交方法检测56例乳腺浸润性导管癌(BIDC)、37例导管原位癌(BDCIS)及53例癌旁正常组织(NBTAC)中的ATM mRNA的表达。结果:①ATM mRNA在BIDC中的表达明显低于NBTAC(P<0.01)。②ATM mRNA在BDCIS的表达低于NBTAC,但无统计学意义。③ATM mRNA在Ⅲ级BIDC中的表达率明显低于Ⅰ级分化组(P<0.05),但Ⅰ与Ⅱ级和Ⅱ与Ⅲ级分化组间ATMmRNA表达率差别无统计学意义。④ATM mRNA表达与肿瘤组织分化程度间呈正相关(r=0.312,P<0.05),即组织分化越低,ATM mRNA表达越低。⑤ATM mRNA的表达与淋巴结转移与否无关。⑥ATM mRNA表达在患者临床分期Ⅱ+Ⅲ期中的表达明显低于Ⅰ期的表达(P<0.05)。结论:ATM mRNA在BTDC组织中表达降低,可为乳腺癌的早期发现和基因干预治疗提供新的思路。

共济失调毛细血管扩张症四例临床表型及基因突变分析

目的报道4例经基因检测明确诊断的共济失调毛细血管扩张症患者,结合文献总结该病临床表型和基因突变特点。方法采集3个共济失调毛细血管扩张症家系共4例患者临床资料,并提取患者及其父母外周静脉血,采用全外显子测序和Sanger测序进行ATM基因突变分析。结果 4例共济失调毛细血管扩张症患者均表现为儿童期发病的进行性进展的小脑共济失调、球结膜和皮肤毛细血管扩张、免疫缺陷导致反复感染,血清甲胎蛋白水平升高,头部MRI显示小脑萎缩。ATM基因检测显示,例1和例2存在已知复合杂合突变c.8287C>T(p.Arg2763X)和c.9139C>T(p.Arg3047X),均为无义突变;例3存在2种未报道的复合杂合突变,包括无义突变c.8911C>T(p.Gln2971X)和缺失突变c.7141_7151del AATGGAAAAAT(p.Asn2381Glufs X18);例4存在纯合突变c.1402_1403del AA(p.Lys468Glufs X18)。结论 4例患者具有典型共济失调毛细血管扩张症临床表现。变异型共济失调毛细血管扩张症患者神经系统受累较轻,头部MRI通常正常,神经系统以外受累少见,明确诊断仍依靠ATM基因检测。

以血尿为突出表现的共济失调毛细血管扩张综合征患儿1例报告并文献复习

目的回顾性分析1例以反复血尿为突出临床表现的共济失调毛细血管扩张综合征(AT)患儿的临床资料及其基因检测结果,并复习相关文献,以提高临床医师对该病的认识。方法对我院儿科收治的1例以血尿为突出表现的AT患儿的临床资料进行回顾性分析,并对相关文献进行复习。结果患儿,男12岁,因反复血尿3年余并进行性加重就诊。患儿自2岁时出现步态不稳,并呈进行性加重;7岁时确诊为急性淋巴细胞性白血病,化疗治疗2.5年后停药,至今完全缓解。现因大量血尿再次就诊。查体可见双眼球结膜毛细血管扩张,小脑性共济失调。尿液检查提示红细胞计数明显升高,以正常红细胞为主。泌尿系超声检查示膀胱内有凝血块,而肾脏、输尿管结构无明显异常。泌尿系CT造影检查均未见异常。基因检测提示患儿ATM基因存在复合杂合突变,分别为c.8357G>T、IVS54+3A>C,均为新发现突变。患儿血尿经膀胱镜证实为膀胱源性,经外科手术电凝后治愈。结论ATM基因c.8357G>T、IVS54+3A>C突变为AT患儿致病突变;AT患儿可因膀胱壁毛细血管扩张出现血尿,甚至可发生大出血而危及生命;如内科止血处理无效应及时行外科手术治疗。

蛋白质体外磷酸化方法的建立

蛋白质的磷酸化与去磷酸化调节方式在细胞信号传递过程中占有极其重要的位置 .建立鉴定蛋白质磷酸化的可靠方法具有重要意义 .毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白 (ataxia telangiectasiamutated ,ATM)是直接感受DNA双链断裂损伤 ,并起始诸多DNA损伤信号反应通路的主开关分子 .电离辐射 (IR)细胞学反应中 ,ATM激酶可通过磷酸化活化 p5 3蛋白 ,原核表达 p5 3融合蛋白 ,免疫沉淀IR活化的野生型ATM蛋白 ,进行蛋白质的体外磷酸化反应 .实验验证了ATM对 p5 3蛋白的磷酸化作用 .这一方法的建立可为研究细胞信号转导途径中蛋白激酶对底物的磷酸化作用及筛查激酶底物提供标准化的技术手段 .

ATM缺失阻碍骨骼肌蛋白质合成的研究进展

恶性体质对国家财政和医疗资源造成极大浪费,而且直接影响个人健康状况和生活质量。毛细血管扩张共济失调(AT)疾病患者普遍身材矮小、肌力和运动能力下降,认为ATM与骨骼肌蛋白质合成有强关联性。文章梳理AT病人与骨骼肌、运动能力的相关实例,简述骨骼肌蛋白质合成机制和ATM与相关分子的调控关系,提出ATM阻碍骨骼肌蛋白质合成的路径假设。

共济失调毛细血管扩张症两例患者临床与ATM基因突变研究

目的 探讨共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia,AT)的临床特征和ATM基因的突变特点。方法 应用聚合酶链反应、逆转录聚合酶链反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA直接测序方法对2例临床诊断AT的患者及其父母ATM基因全编码区进行突变检测。结果 2例AT患者的临床特征为儿童期起病的进行性发展的小脑性共济失调,眼、皮肤毛细血管扩张以及免疫缺陷导致的反复感染;血清甲胎蛋白高于正常,免疫球蛋白IgA、IgG值低于正常;头颅MRI显示小脑萎缩,脑SPECT显示小脑局部脑血流(rCBF)灌注减少。共发现3种碱基变异。在1例患者中发现外显子11G1346C的错义突变,为一种纯合突变;在另1例患者中发现外显子6G610T的无义突变和外显子47C6679T的错义突变,为一种复合性杂合突变。突变位点均位于ATM基因功能域。结论 作出了2例AT患者的基因诊断。报道了3种新的ATM基因突变。

共济失调毛细血管扩张突变基因沉默可抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭

目的 :探讨共济失调毛细血管扩张突变(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)基因沉默对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 :将携带ATM-sh RNA及其阴性对照序列(作为阴性对照组)的重组慢病毒载体分别感染人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞,获得ATM基因稳定沉默及其对照细胞株;同时,设置未经病毒感染的空白对照组细胞。经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察各组细胞的感染效率,并采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测ATM mRNA及蛋白的表达水平。采用MTT法、FCM法、细胞划痕愈合实验和Transwell小室实验分别检测ATM基因沉默对MDA-MB-231细胞增殖、周期分布、迁移和侵袭能力的影响。结果:成功构建了稳定沉默ATM基因的人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株。与空白对照组和阴性对照组相比,ATM基因沉默组细胞的增殖能力和细胞周期分布均无明显变化(P值均>0.05),但细胞迁移和侵袭能力均明显减弱(P值均<0.05)。结论:在人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中,ATM表达下调可明显抑制细胞的迁移和侵袭。

塞来昔布对胶质瘤U251细胞株放射敏感性的影响

目的:探讨环氧化酶-2抑制剂塞来昔布(celecoxib)对胶质瘤放射治疗的增敏作用及可能的作用机制。方法:体外培养胶质瘤U251细胞株并将其分为5组,分别加入不同浓度的塞来昔布,并采用60Go照射,噻唑蓝检测细胞的抑制率,免疫组织化学法测细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达,RT-PCR检测毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(ATM)的表达变化。结果:随着塞来昔布浓度的增加,细胞生长的抑制率明显上升,肿瘤细胞中ATM和EGFR蛋白的表达明显减弱。结论:塞来昔布能够通过降低ATM和EGFR蛋白的表达,增强胶质瘤的放疗敏感性,对胶质瘤的治疗具有重要意义。

ATM基因在髓性白血病原代细胞中的表达及其对基因治疗的意义

目的 研究在髓性白血病原代细胞和肿瘤细胞株中共济失调毛细血管扩张症突变基因(ATM) 的转录水平, 以确定反义封闭ATM基因治疗在白血病中应用的可行性。方法 利用半定量RT -PCR技术, 检测了正常人及31例髓性白血病患者和9种肿瘤细胞株的ATM mRNA表达量。结果 31例髓性白血病患者及9种肿瘤细胞株中ATMmRNA表达量普遍降低。结论 由于白血病患者中ATM mRNA表达量普遍降低, 因此, 反义封闭ATM对于白血病原代细胞基因治疗的适应性有待商榷。

ATM基因单核苷酸多态性与职业性辐射致染色体损伤的相关性

目的通过对共济失调性毛细血管扩张症（AT）突变基因ATM进行分型,探寻其单核苷酸多态性（SNP）与职业性放射损伤的关系,了解放射性损伤的分子机制及个体辐射敏感性的差异,为放射卫生防护提供高危人群筛查依据.方法选择有染色体畸变的X、γ和β射线放射作业人员87例作为染色体损伤组,采用1∶1配对设计方案,同时选择与染色体损伤组同性别、年龄相仿、年平均剂量当量相差≤1 mSv且无染色体畸变和血常规异常的放射作业人员87名为对照组.选择ATM基因的3个SNP位点（rs373759、rs189037、rs4988044）,采用基于荧光标记单碱基延伸（SNE）原理的SNaPshot分型技术进行基因分型. 结果rs189037位点存在G〉A碱基转换型变异,染色体损伤组突变基因型GA/AA的基因频率为81.6%,明显高于对照组{64.4%;χ^2=5.297,P〈0.05;比值比（OR）[95%可信区间（CI）]=2.364（1.136～4.919）}.染色体损伤组rs189037位点A等位基因频率为53.4%,稍高于对照组（44.3%）,但2个组之间差异无统计学意义[χ2=2.944,P〉0.05;OR（95%CI）=0.691（0.453～1.054）].rs373759位点和 rs4988044位点的基因型分布与等位基因频率在染色体损伤组与对照组间差异无统计学意义（P〉0.05）.结论ATM基因rs189037位点GA/AA基因型的个体放射敏感性增加;未发现rs373759、rs4988044位点SNP与辐射致染色体损伤有关;ATM基因SNP对辐射致染色体损伤有影响.

持续低剂量率辐射下HepG_2细胞辐射敏感性与ATM磷酸化的关系

目的探讨持续低剂量率辐射下HepG2细胞ATM磷酸化的变化及其对HepG2细胞增殖活性的影响。方法体外培养的HepG2细胞分别接受持续低剂量率(7.76cGy/h)和高剂量率(4500cGy/h)电离辐射,比较同等剂量下低剂量率和高剂量率辐射后HepG2细胞ATM磷酸化程度和细胞存活分数。结果无论给予低剂量率或高剂量率照射,HepG2细胞接受0.5Gy的电离辐射时,ATM蛋白均可达到最大的磷酸化。随着辐射剂量的增加,在持续低剂量率辐射下,HepG2细胞ATM磷酸化蛋白表达逐渐减弱;而在高剂量率辐射下,ATM磷酸化蛋白稳定不变。当高、低剂量率辐射诱导产生的ATM磷酸化程度相当时,两者的存活分数无明显差异(P>0.05);当持续低剂量率辐射组ATM磷酸化蛋白表达明显弱于高剂量率辐射组时,HepG2细胞的存活分数显著低于高剂量率辐射组(P<0.01)。结论持续低剂量率辐射增加了HepG2细胞的辐射敏感性,其机制与持续低剂量率辐射下部分ATM磷酸化蛋白失活有关。抑制ATM磷酸化,可以增加HepG2肝癌细胞的辐射敏感性。

干扰ATM基因表达增强胃癌细胞AGS的放射敏感性

为探讨RNA干扰共济失调毛细血管扩张性突变(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM)基因表达后对胃癌细胞AGS放射敏感性的影响,通过构建ATM基因RNA干扰质粒转染AGS细胞,获得干扰效率高的克隆细胞AGS-Ri-ATM,并采用RT-PCR和Western blot分别检测m RNA和蛋白表达水平,平板克隆形成实验观察细胞经放射后对细胞生长的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。检测结果显示其ATM基因表达被干扰下调。经X射线照射至不同吸收剂量,AGS-Ri-ATM平板克隆形成数量/率远低于AGS-Vector的平板克隆形成数量/率,差异显著(p<0.05),具有统计学意义。流式细胞术检测显示当吸收剂量为4 Gy时,AGS-Ri-ATM被阻滞在G1期,同时在12 h后出现明显的凋亡想象。结果表明,ATM基因被干扰后可以诱导细胞周期的阻滞,以及凋亡的增加而增强AGS细胞的放射敏感性。

原发性肝癌ATM基因启动子甲基化及其与放疗疗效的相关性

为探究原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)共济失调-毛细血管扩张突变基因(ataxia-telangiectasia mutated gene, ATM)启动子甲基化情况,分析其与临床特征的关系及与放疗疗效的相关性,采用甲基化特异性PCR法(methylation-specific PCR, MSP)检测50对肝癌手术标本及相应的癌旁肝组织标本、20例正常肝组织、38例局部中晚期肝癌肝穿刺标本的ATM基因启动子甲基化状态,并采用BSP (bisulfite sequencing PCR)测序法对样本的甲基化状态进行验证,分析ATM基因启动子甲基化状态与患者临床特征的关系及与放疗疗效的相关性。结果发现, 88例肝癌组织中ATM基因启动子甲基化率为39.8%(35/88),其中38例肝癌肝穿刺标本有42.1%(16/38)存在ATM基因启动子甲基化, 50例肝癌手术标本有38%(19/50)存在ATM基因启动子甲基化,相应癌旁肝组织只有8.0%(4/50)存在ATM基因启动子甲基化;正常肝组织未发现有ATM基因启动子甲基化, ATM基因启动子甲基化在肝癌组织中的发生率与癌旁肝组织、正常肝组织相比差异具有统计学意义(χ^2=24.818,P<0.05)。此外,存在ATM基因启动子甲基化的局部中晚期肝癌患者的放疗疗效显著优于无甲基化的病例(χ^2=5.955,P=0.015), ATM基因启动子甲基化状态与肝癌放疗疗效呈显著正相关关系(r=0.396, P=0.014)。实验结果表明原发性肝癌ATM基因启动子存在异常甲基化, ATM基因启动子甲基化状态与肝癌放疗疗效关系密切,可为筛选放射敏感差异病人提供新的思路。

DAB2IP基因沉默引起的前列腺癌细胞辐射耐受与ATM的相关性研究

实验以具有不同卵巢癌差异表达基因2相互作用蛋白(Disabled homolog 2 interaction protein,DAB2IP)表达的前列腺癌细胞为研究对象,讨论DNA损伤修复关键蛋白-共济失调毛细血管扩张症基因突变(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM)在DAB2IP影响肿瘤细胞放射敏感性中的作用。研究比较了单纯γ-射线(0、2、4、6、8 Gy)和ATM特异性抑制剂-KU55933(10μmol/L)联合射线作用后,不同DAB2IP表达的前列腺癌细胞集落形成率的差异;采用q RT-PCR及Western blot方法分别检测了2 Gy和KU55933+2 Gy照射后,细胞内ATM在翻译转录、蛋白表达和磷酸化水平的变化。结果显示,同一吸收剂量下,DAB2IP基因沉默的前列腺癌细胞,集落形成能力明显高于DAB2IP阳性表达的对照组细胞,并伴随着ATM合成与磷酸化水平的升高。KU55933通过抑制ATM的翻译转录与蛋白磷酸化,可显著增强射线对低表达DAB2IP的辐射耐受细胞的损伤作用。提示ATM是DAB2IP基因沉默引起肿瘤细胞辐射耐受的关键分子,可以ATM为靶点筛选药物,提高DAB2IP基因缺陷的肿瘤患者对放射治疗的敏感性。

ATDC蛋白在大肠癌中的表达及意义

目的探讨共济失调性毛细血管扩张D组互补基因（ATDC）表达在大肠癌的发生发展中的作用及其临床意义。方法应用免疫组织化学方法检测大肠癌病人癌组织和正常大肠组织中的ATDC蛋白表达和定位，Westernblot和RT-PCR定量ATDC蛋白的表达水平，分析ATIX；蛋白和临床病理参数之间的关系。结果ATDC蛋白在正常组织和癌组织表达差异有统计学意义（P〈0．05），癌组织中ATDC表达在性别、年龄、Dukes分期因素之间差异无统计学意义，在淋巴结转移及分化程度因素间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论ATDC在癌组织中表达升高提示其可能参与了肿瘤的发生发展。检测ATDC表达对于大肠癌的诊断和判断预后有一定的意义。

拓扑异构酶抑制剂通过ATM/ATR和NF-κB途径上调乳腺癌细胞MICA/B的表达

目的:分析常用化疗药物对免疫识别乳腺癌细胞重要的靶标主要组织相容性复合体Ⅰ类相关分子A和B(major histocompatibility complex classⅠ-related chain A and B,MICA/B)的影响,探讨其调节MICA/B表达的分子机制。方法:用荧光定量RT-PCR法检测化疗药物对乳腺癌细胞MICA和MICB mRNA表达的影响,流式细胞术检测化疗药物对MICA/B表面蛋白表达的作用。加入咖啡因抑制毛细血管扩张性共济失调突变和Rad3相关激酶(ataxia telangiectasia mutated and Rad3-related kinase,ATM/ATR),加入吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pynolidine dithiocarbamate,PDTC)抑制核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB),观察其是否能够抑制化疗药物中拓扑异构酶抑制剂对乳腺癌细胞MICA和MICB mRNA及蛋白的表达。凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测药物是否影响乳腺癌细胞NF-κB与MICA/B启动子区的结合。结果:三种拓扑异构酶抑制剂足叶乙甙、拓扑替康和阿霉素可使乳腺癌MCF-7细胞的MICA和MICB mRNA水平升高。足叶乙甙在浓度为5、20、100μmol/L时,与不加药处理组相比,MICA mRNA水平分别升高到(1.68±0.17)、(2.54±0.25)、(3.42±0.15)倍(P<0.05);MICB mRNA水平分别升高到(1.82±0.24)、(1.56±0.05)、(5.84±0.57)倍(P<0.05)。拓扑替康和阿霉素在特定浓度时也使MCF-7的MICA和MICB mRNA水平显著升高(P<0.05)。拓扑异构酶Ⅱ抑制剂足叶乙甙和拓扑替康处理另一乳腺癌细胞系SK-BR-3后,MICB mRNA的表达也轻度升高(P<0.05)。足叶乙甙和拓扑替康还增加MCF-7细胞表面MICA/B蛋白的表达(P<0.05),且存活和凋亡细胞MICA/B蛋白的表达均增高。用不同浓度的咖啡因处理足叶乙甙损伤的乳腺癌细胞,MICA/B mRNA和蛋白表达均显著降低,当咖啡因浓度为1、5、10 mmol/L时,MICA mRNA相对表达水平由不用咖啡因处理组的(3.75±0.25)倍分别降为(0.89±0.05)、(0.81±0.02)、(0.48±0.04)倍(P<0.001),MICB mRNA由(6.85±0.35)倍降为(1.36±0.13)、(0.76±0.06)、(0.56±0.03)倍(P<0.05),MICA/B蛋白表达由(3.42±0.05)倍降为(1.32±0.03)、(1.21±0.06)、(1.14±0.03)倍(P<0.001),表明足叶乙甙对MICA/B的上调作用能够被ATM/ATR抑制剂所抑制。同样,加入不同浓度的NF-κB的强抑制剂PDTC(10、50、100μmol/L),MICA/B mRNA和蛋白的表达均明显受到抑制(P<0.05),提示NF-κB也参与这一过程。EMSA实验显示,MCF-7细胞用足叶乙甙处理后,NF-κB与MICA/B基因启动子区的结合活性增强。结论:拓扑异构酶抑制剂诱导并上调乳腺癌细胞MICA和MICB mRNA及表面蛋白的表达,表明化疗药物有可能增强免疫系统对乳腺癌的识别和杀伤,ATM/ATR和NF-κB途径参与了这一过程。

稳定表达反义ATM/PI3K细胞系U937-ASPI3K的建立

为进一步研究DNA损伤杀灭肿瘤细胞的机制 ,为增强肿瘤治疗疗效提供一种有价值的细胞模型 ,构建了高效表达ATM基因编码羧基端 10 0kD功能片段的反义cDNA ,通过转染和筛选建立稳定表达反义ATM PI3KcDNA的细胞系U937 ASPI3K。结果显示 ,构建的ATM PI3KcDNA经测序证明反向定位于表达载体 pZeoSV2 (+ )中。经转染和筛选得到稳定表达 pZeoSV(+ ) ATM PI3K的细胞系U937 ASPI3K和对照细胞系U937 pZeoSV (- ) ,前者ATM蛋白表达极度受抑制 ,后者以及淋巴瘤细胞系U937ATM蛋白的高表达未受影响。本实验为阐明细胞周期关卡 (checkpoint)在DNA损伤信号传导通路中的作用机制 。

ATM基因突变与细胞辐射敏感性关系研究进展

共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)是 AT唯一的致病基因,AT是一种常染色体隐性遗传病,其临床特征有小脑退化、免疫缺陷、染色体不稳定性、细胞周期紊乱,对放射线及类射线细胞毒药物极度敏感等.由于AT患者这种特殊的遗传性的辐射敏感性,使得ATM成为放射生物学界研究辐射敏感性机制的重要对象之一.笔者就ATM基因的结构功能、ATM基因突变和细胞辐射敏感性机制以及二者之间关系做一综述.