电刺激小脑顶核联合神经干细胞共移植体治疗大鼠局灶性脑缺血

目的:观察局灶性脑缺血大鼠植入神经干细胞共移植体联合电刺激小脑顶核对新生血管密度的影响。方法:实验于2005-08/2006-11在佳木斯大学神经科学研究所完成。①实验分组:选取同一基因背景大鼠96只,随机数字表法分成4组:神经干细胞组、电刺激+神经干细胞组、神经干细胞共移植体组、电刺激+神经干细胞共移植体组,24只/组,移植后3,7,14,60d每个时间点各6只;另取新生24h内Wistar鼠1只用于神经干细胞的培养。共移植体由神经干细胞、层粘连蛋白和血管内皮细胞构成,由本实验室提供并鉴定。②实验方法:各组大鼠均采用线栓法建立大脑中动脉缺血模型,其中电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组于造模前1d行小脑顶核电刺激。以前囟为零点、正中线向后11.6mm、正中线向右1.2mm钻开颅骨后,用电针刺入脑内深5.6mm,给予直角方波脉冲刺激,电流强度为50μA,频率为0～100Hz,时程为0.5ms,连续刺激1h。各组均在造模后3d进行移植,移植部位为右侧纹状体缺血半暗带区。移植前分别将培养的神经细胞、神经细胞共移植体溶解于磷酸盐缓冲液中,细胞浓度调整为2×1010L-1。单纯神经干细胞组、电刺激+神经干细胞组植入神经干细胞悬液10μL,神经干细胞共移植体组、电刺激+神经干细胞共移植体组植入神经干细胞共移植体悬液10μL。③实验评估:各组分别于移植后3,7,14,60d腹腔麻醉取脑,制作石蜡切片,免疫组织化学法检测新生血管生成情况。结果:①新生血管免疫组织化学检测结果:新生血管是由单层扁平上皮细胞构成的,经免疫组化DAB显色后,新生血管内皮细胞的胞浆呈棕黄色,存在基底膜完整、不完整或无基底膜3种情况。②各种干预因素在不同时间点对新生血管生成的影响:各组在移植后3d均有新生血管生成,7d生成数量达到高峰,14d生成数量开始减少,至60d有较少的新生血管生成。以上各时间点电刺激+神经干细胞共移植体组新生血管密度均显著高于另外3组(F=7.12～15.86,P均<0.05)。结论:电刺激小脑顶核与神经干细胞共移植体移植能够促进大鼠局灶性脑缺血区新生血管的生成。

电刺激小脑顶核促进大脑中动脉缺血鼠共移植体中神经干细胞向神经元的分化

目的:向大脑中动脉缺血大鼠植入神经干细胞,探讨电刺激小脑顶核与神经干细胞共移植体对其向神经元分化的影响。方法:实验于2005-08/2006-11在佳木斯大学神经科学研究所完成。①选取同一基因背景大鼠72只,随机数字表法分成3组:神经干细胞移植组、电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组,24只/组。②另选取出生24h内的Wistar鼠1只用于神经干细胞的分离,制备单细胞悬液,调整细胞密度为5×108L-1,置于10mg/L的Brdu完全培养液中孵育72h。神经干细胞共移植体由神经干细胞、层粘连蛋白和血管内皮细胞构成,由本实验室提供并鉴定。③各组大鼠于造模前1d麻醉后行小脑顶核刺激,以前囟为零点、正中线向后11.6mm、正中线向右1.2mm。给予直角方波脉冲刺激,电流强度为50μA,频率80Hz,时程1h。④各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血动物模型。造模1d后,分别将培养的神经干细胞及共移植体细胞浓度调整为2×1010 L-1,于缺血纹状体侧缺血半暗带区垂直进针,进入5.0mm后缓慢推入细胞悬液,神经干细胞移植组、电刺激+神经干细胞组移植神经干细胞悬液10μL,电刺激+神经干细胞共移植体组移植神经干细胞共移植体悬液10μL,移植速度为0.5μL/min,留针10min后缓慢拔针。⑤各组分别于移植后3,7,14,60d观察神经干细胞移入脑内后分化成神经元的情况。胞核呈绿色荧光、胞质呈红色荧光的为Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞,代表移植入的神经干细胞所分化的神经元。结果:72只同一基因背景大鼠均进入结果分析。①与神经干细胞移植组比较,移植后7,14,60d电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显升高(F=12.44～25.18,P均<0.05)。移植后3,7,14,60d电刺激+神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显高于电刺激+神经干细胞组(F=8.19～25.18,P均<0.05)。②随移植时间的延长,各组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞形态均逐渐增大,至移植后60d时细胞周边可见突起。结论:大脑中动脉缺血模型鼠移植入神经干细胞后,电刺激小脑顶核能够对神经干细胞向神经元的分化产生促进作用,且共移植体与电刺激小脑顶核具有协同效应。

神经干细胞与脑微血管内皮细胞共移植体联合电刺激小脑顶核对局灶性脑缺血大鼠突触素P38表达的影响

背景：突触素P38广泛存在于机体所有神经终末，与神经生长、修复、再生和突触重塑密切相关。目的：实验假设细胞移植及电刺激治疗对突触素P38具有调节作用，拟验证这种作用对局灶性脑缺血大鼠突触素P38表达的影响，设计、时间及地点：随机对照动物实验及细胞观察，于2005—0812007—02在佳木斯大学神经科学研究所完成。材料：清洁级8周龄Wistar大鼠96只，随机分为神经干细胞组、电刺激＋神经干细胞组、共移植体组、电刺激＋共移植体组，24只，组。另取新生24h内Wistar鼠和1～7d龄Wistar鼠各2只，分别用于神经干细胞、脑微血管内皮细胞的分离培养。方法：将传代的脑微血管内皮细胞按3×10^7L^-1密度接种在培养瓶中，贴壁后吸出脑微血管内皮细胞培养液，涂一层层粘连蛋白后接种于神经干细胞上，密度为6×10^7L^-1，待神经干细胞贴壁后吸出培养液，再涂以一层层粘连蛋白，接种3×10^8L^-1密度的脑微血管内皮细胞，共培养12～24h，将细胞从瓶壁上依次刮起，适力吹打成1~3个脑微血管内皮细胞与5～18个神经干细胞相互包绕的细胞团，过滤后筛网上的细胞团即为神经干细胞-脑微血管内皮细胞的共移植体。各组大鼠均采用线栓法建立大脑中动脉缺血模型，其中电刺激＋神经干细胞组、电刺激＋共移植体组大鼠于造模前1d行小脑顶核刺激，电流强度50μA，频率100Hz，时程0．5ms，连续刺激1h。造模后3d将培养的神经干细胞、共移植体溶解于磷酸盐缓冲液中，调整浓度为2×10^10L^-1，各组均于右侧纹状体缺血半暗带区移植对应悬液10μL。主要观察指标：移植后3，7，14．60d免疫组织化学法检测缺血区突触素P38的表达。结果：光学显微镜下突触素P38阳性细胞染色呈棕黄色点状或颗粒状沉积，分布较密集，主要分布在神经毡内，部分围绕在神经元胞体周围。移植后各时间点电刺激＋神经干细胞组、共移植体组、电刺激＋共移植体组脑缺血区突触素P38的表达均明显高于神经干细胞组（P〈0.05）：且电刺激＋共移植体组升高幅度显著大于前2组（P〈0．05）。并随移植时间的延长突触素P38表达逐渐增加（P〈0．05）。结论：电刺激小脑顶核与共移植体整体干预有助于脑缺血区突触素P38的表达，作用优于单纯神经干细胞、单纯共移植体或电刺激＋神经干细胞等移植方式。

神经干细胞共移植体对MCAO模型大鼠新生血管密度表达的影响

目的探讨神经干细胞共移植体移植对局灶性脑缺血模型大鼠新生血管密度的影响。方法同一基因背景Wistar大鼠48只,随机分成两组:A对照组(单纯神经干细胞移植),B神经干细胞共移植体移植组。采用线栓法建立大脑中动脉缺血模型,3 d后应用立体定向法将神经干细胞、神经干细胞共移植体分别移植到大脑中动脉缺血模型大鼠的纹状体缺血半暗带区,各组分别于3、7、14、60 d腹腔麻醉取脑,制作石蜡切片,采用免疫组化方法观察缺血区新生血管的生成情况。结果 (1)A组:在局灶性脑缺血区,3 d有新生血管生成,7 d新生血管生成达高峰,14 d新生血管生成开始逐渐减少,60 d几乎没有新生血管生成;(2)B组:3 d新生血管生成明显增加,7 d新生血管生成达高峰,14 d新生血管生成开始减少,60 d仍有新生血管的生成。在各时间点B组与A组进行比较,新生血管的密度明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论神经干细胞共移植体移植能够促进大鼠局灶性脑缺血区新生血管的生成。

共移植体对神经干细胞向神经元分化的影响

目的:探讨共移植体所构成的微环境对神经干细胞移植后向神经元分化的影响。方法:48只同一基因背景的Wistar大鼠,随机分为:NSCs移植组,共移植体移植组。在新生的同一基因背景鼠海马取神经干细胞和大脑皮质取血管内皮细胞,把单独NSCs和共移植体移植入同一基因背景大鼠MCAO造模后24h缺血半暗带区,Brdu标记其中NSCs,利用免疫荧光双标于3d,7d,14d,60d分别观察NSCs向神经元分化情况。结果:在7d,14d,60d三个时间点神经干细胞向神经元分化中,共移植体组神经元分化率高于NSCs组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:共移植体对移植入MCAO模型大鼠的NSCs向神经元分化有促进作用。