超高分辨率激光扫描共聚焦显微镜的成像技术与应用

超高分辨率激光扫描共聚焦显微镜在生命科学研究领域中的应用日益广泛。该文以Zeiss LSM 880 Airyscan with STEDYCON超分辨率激光共聚焦显微镜为例,介绍了Airyscan技术和基于受激发射现象的超分辨技术(STED)的原理、应用和参数设置,以期能够为科研工作者究竟采用哪种模式进行图像采集提供参考,以获得最佳的成像效果。

针孔参数优化对激光扫描共聚焦显微镜荧光成像的影响

激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是一种高分辨率的光学成像仪器,它利用“共轭成像”原理,获得的图片质量远超于普通荧光显微镜。LSCM有两组功能不同的针孔,即照明针孔和探测针孔,这是实现“共轭成像”的关键。由于照明针孔的大小和位置一般是固定的,LSCM主要通过调节探测针孔的大小来获得高质量的成像图片。然而,很多使用者对于LSCM中针孔大小与荧光成像质量的关联缺乏了解。因此,本文阐述了针孔在LSCM中的作用原理及其与显微镜分辨率的关系,并通过小鼠脊髓腹侧白质中的免疫荧光成像分析,发现针孔参数优化对提高LSCM荧光成像质量具有显著影响。这一发现将为LSCM成像分析提供重要参考。

激光扫描共聚焦显微镜玻片高通量自动化成像的方法

激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)是目前生物医学研究的主要设备之一,但在实验过程中,发现了商业化部分显微镜适配器无法实现高通量及传统拍摄方法存在着大量重复操作的问题。针对这一问题,开发了多玻片高通量自动化成像方法,实现共聚焦显微镜的一键式自动化图像采集。它可用于相同型号的显微镜,也可以让仪器在非工作时间实现无人值守自行运行,从而充分释放平台的服务潜能,提高仪器的使用效率。

激光共聚焦显微镜应用于本科生的实验教学设计

激光共聚焦显微镜等大型仪器的实验教学是实现“新工科”建设的重要推动力,然而目前针对本科生的大型仪器教学却未得到有效普及。通过选取适合于本科生实践操作的微生物荧光染色观察实验以及基于“雨课堂”进行线上线下教学,发挥激光共聚焦显微镜可视化强的特点,激发本科生的求知欲望和探索热情,增强学生的主观能动性,促进以教师为主导向以学生为中心的教学模式转变。实践教学表明,易于操作、可视化强的实验方案有助于学生理解和掌握激光共聚焦显微镜相关的基础知识和未来应用,拓宽学生的知识面和科研视野,提高本科生的实践创新能力。

共聚焦显微镜线性扫描控制系统设计

为了实现共聚焦显微镜系统中的振镜线性扫描,并改善振镜噪声及系统稳定性,设计了基于FPGA的振镜扫描控制系统。该系统通过FPGA生成振镜扫描信号,输出信号幅值、频率精准,通过ARM芯片与上位机通讯,实现振镜系统的扫描控制。在扫描波形上,通过对三角波端点处进行三次样条插值处理,使振镜扫描过程中速度及加速度连续,提高振镜运行稳定性。在输出波形上通过累加器进行频率控制,提高了频率分辨率。实验表明,设计的振镜扫描控制系统波形、频率及幅值准确,成像效果清晰、细腻,并可有效降低振镜噪声。

反射式共聚焦显微镜联合光学相干断层成像在黄褐斑微观辨证中的作用

目的探讨不同中医证型女性黄褐斑皮损的微观差异。方法收集2023年1月—2023年12月在华中科技大学同济医学院附属武汉中西医结合医院皮肤科门诊确诊的113例女性黄褐斑患者,在判断其符合纳入标准并征得患者知情同意后,收集整理患者资料并对其进行中医分型,将黄褐斑分为肝郁血瘀型、脾虚型、肾阳虚型及肝肾阴虚型。同时对各型患者行反射式共聚焦显微镜(RCM)、光学相干断层成像(OCT)检查,观察和分析女性黄褐斑各中医证型皮肤组织形态学特征。结果113例女性黄褐斑患者中,中医辨证分型包括肝郁血瘀型51例(45.13%),脾虚型34例(30.09%),肾阳虚型16例(14.16%),肝肾阴虚证12例(10.62%)。入选对象皮损处RCM下表皮色素数量分布均见增加,以patternⅡ、patternⅢ模式占比居多;均有显著的黑素细胞活跃现象,主要以patternⅠ、patternⅡ模式占比居多,四种主要证型间无显著差异。肝肾阴虚型RCM下以混合型改变为主,表皮黑素颗粒分布明显增多,黑素细胞明显活跃,黑素细胞悬垂及真皮层噬黑素细胞浸润均显著;脾虚型RCM下以表皮型改变为主,真皮内噬黑素细胞浸润出现比例较低;OCT观察发现黄褐斑皮损毛细血管网深度,平均分布在皮下54.57±14.19μm之间,四种主要证型间无统计学差异。肝郁血瘀型黄褐斑皮损中,血管扩张改变较其他三型显著。结论不同中医证型黄褐斑皮损,其组织学改变具有一定差异性和规律性,皮肤影像学指标可为中医辨证,个体精准化治疗提供必要的客观参考依据。

反射式共聚焦激光扫描显微镜在会阴色素减退性疾病中的应用

目的探讨反射式共聚焦激光扫描显微镜(reflectance confocal microscopy,RCM)在会阴色素减退性疾病中的应用价值。方法回顾性分析2018年1月—2021年12月就诊于新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科37例患者会阴色素减退性疾病的临床、RCM及组织病理学特征。结果37例患者中白癜风15例,硬化性苔藓13例,无色素痣2例,神经性皮炎4例,皮脂腺异位1例,非特异性炎症后色素减退2例。37例患者的皮损在RCM检测的同一部位进行组织病理检查,诊断均符合RCM。结论RCM有助于会阴色素减退性疾病的诊断及鉴别诊断,对白癜风及硬化性苔藓的分期也有辅助作用。

激光扫描共聚焦显微镜辅助诊断诺卡菌性角膜炎1例

患者,女,57岁,因无明显诱因出现右眼异物感、视力下降1个月余,于2020年1月至成都东区爱尔眼科医院就诊后收治入院。否认糖尿病病史。患者曾于外院诊断为角膜炎,于10 d前在外院行角膜激光扫描共聚焦显微镜检查,报告发现菌丝,给予常规抗细菌治疗无效转至本院就诊。眼科检查:视力右眼0.02(-2.00 DS/-0.50 DC×90°=0.15),左眼0.08(-3.50 DS/-2.00 DC×90°=1.0);右眼眼压12.4 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),左眼眼压15.9 mmHg;右眼结膜混合充血(+),角膜中央瞳孔区可见一直径约2 mm灰白色圆形浸润灶,溃疡达浅基质层,溃疡底部较清洁,可见2个灰白色隆起针尖状病变(图1A),角膜中央直径2 mm荧光素钠染色阳性(图1B),右眼KP(-),Tyndall征(-),晶状体透明,玻璃体和视网膜未见明显异常。左眼前后节均未见明显异常。患者空腹血糖12.38 mmol/L。入院后立即行角膜刮片细胞学检查和细菌、真菌微生物培养,结果均为阴性。激光扫描共聚焦显微镜(HRT3,德国海德堡公司)检查在角膜浅基质层可见纤细分支、略微弯曲的高反光丝状结构,初次报告为“菌丝”(图2)。

眼表综合分析仪联合角膜激光共聚焦显微镜检查对睑缘炎相关性角结膜病变45例的价值

目的应用眼表综合分析仪和角膜激光共聚焦显微镜(IVCM),探讨睑缘炎相关性角结膜病变(BKC)病人角膜细胞密度和眼表功能的变化及与蠕形螨感染的关系。方法选取2020年9月至2022年3月就诊于沧州市中心医院的45例BKC病人为观察组,同期的健康志愿者45例为对照组。根据观察组是否感染蠕形螨,分为蠕形螨感染组和未感染组。对所有研究对象使用眼表综合分析仪和IVCM进行检查,收集观察组和对照组的非侵入式平均泪膜破裂时间(NITBUTav)、非侵入式首次泪膜破裂时间(NIBUTf)、角膜荧光素染色(FL)评分、泪液分泌试验(SⅠt)、蠕形螨感染情况和角膜细胞密度。Pearson相关性分析蠕形螨感染数量与病人角膜细胞密度及眼表功能的相关性。结果观察组的NITBUTav[(6.31±2.95)s比(14.85±3.88)s]和NIBUTf[(4.65±2.03)s比(11.88±3.14)s]低于对照组,FL评分高于对照组(P<0.05)。观察组蠕形螨感染阳性率高于对照组,中央角膜浅基质层的细胞密度低于对照组(P<0.05)。观察组下方角膜基底细胞层和浅基质层的细胞密度低于对照组(P<0.05)。蠕形螨感染组的FL评分高于未感染组,下方角膜基底细胞层、浅基质层和中央角膜浅基质层的细胞密度低于未感染组(P<0.05)。蠕形螨感染数量与BKC病人下方角膜基底细胞层、浅基质层和中央角膜浅基质层的细胞密度呈负相关,与FL评分呈正相关(均P<0.05)。结论眼表综合分析仪联合IVCM可对BKC病人的眼表损害进行综合评价;BKC病人下方角膜基底细胞层、浅基质层和中央角膜浅基质层的细胞密度降低,FL评分增加,与蠕形螨感染数量增多有关。

激光共聚焦显微镜样本制备在研究生实验教学中的应用

激光共聚焦显微镜是一种多功能、高分辨率、高效率的光学设备,在植物细胞结构中通过荧光探针标记相关基因,获得清晰的亚细胞定位信息,如细胞膜、细胞器等结构。以烟草为实验材料,在研究生实验教学中利用LSCM880激光扫描共聚焦显微镜观察烟草下表皮细胞,通过优化样本制作,最终获取清晰的图片。通过实验教学,学生掌握激光共聚焦显微镜的原理、样品制备及操作步骤,提高理论知识与实践操作相结合的能力,加强其对激光共聚焦显微镜的掌握及运用。

活体激光共聚焦显微镜观察蠕形螨感染与麦粒肿关系的临床研究

目的 采用活体激光共聚焦显微镜(IVCM)观察麦粒肿和霰粒肿患者眼部蠕形螨感染情况,为分析蠕形螨感染对麦粒肿发生的影响提供参考依据。方法 选取2022年6—12月在上海爱尔眼科医院就诊为霰粒肿的患者45例(45眼)称霰粒肿组及无霰粒肿史的麦粒肿患者45例(45眼)称麦粒肿组。每位患者采取活体激光共聚焦显微镜观察患眼睑缘蠕形螨感染情况,上下睑缘选取累及所在位置8个毛囊、8个睑板腺。以蠕形螨检出≥3只为阳性、1≤蠕形螨<3只为可疑阳性、未检出为阴性。结果 活体激光共聚焦显微镜下,麦粒肿组和霰粒肿组蠕形螨感染阳性率分别为73.30%(33眼)、44.44%(20眼),可疑阳性率为31.11%(14眼)、11.10%(5眼),阴性率为15.60%(7眼)、24.44%(11眼);麦粒肿组阳性感染率明显高于霰粒肿组,差异具有统计学意义(P=0.013)。结论 与霰粒肿患者相比,麦粒肿患者的蠕形螨感染率更高,蠕形螨感染可能亦是麦粒肿发生的致病因素之一。

高内涵分析系统联合激光扫描共聚焦显微镜观察细胞间隧道纳米管

目的隧道纳米管(tunneling nanotubes,TNTs)是存在于细胞间的膜管样结构,具有直接且远距离的生物信息交换功能。TNTs因结构易破坏、存在时间短以及形成后不稳定,故观察其动态形成与功能存在一定难度。而本研究采用高内涵分析系统(HCA)联合激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)尝试观察TNTs形成的动态过程及其对囊泡物质的转运功能。方法荧光探针标记人肺腺癌A549及顺铂耐药A549/DDP细胞,分别利用HCA观察TNTs形成过程、LSCM观察TNTs三维结构、HCA联合LSCM分析TNTs囊泡物质转运功能。结果同种肿瘤细胞(A549或A549/DDP)间、不同亚型肿瘤细胞(A549与A549/DDP)间均可形成TNTs结构;与A549细胞相比,A549/DDP细胞间TNTs结构长且粗、形成指数高(A549和A549/DDP细胞TNTs长度、直径和形成指数分别为14.71μm、2.27μm、4和25.44μm、2.59μm、11);肿瘤细胞间通过细胞接触-膜融合-细胞反向易位-胞膜融合区拉长变细,以及细胞膜凸起-膜凸起丝状伪足样拉长-膜凸起与其他细胞膜/膜凸起融合两种方式形成TNTs;TNTs囊泡转运功能具有双向性,囊泡转运速率及数量因转运阶段和供体细胞不同而存在差异,A549/DDP细胞向A549细胞进行囊泡转运过程中表现为囊泡转运速率初始快、末期慢,A549作为供体细胞向受体A549/DDP细胞转运的囊泡数量和比例高于A549/DDP作为供体细胞的反向转运。结论HCA联合LSCM可有效观察、分析TNTs动态形成过程及囊泡物质转运功能。

活体激光扫描共聚焦显微镜在睑缘蠕形螨检查中的应用

目的 对比活体激光扫描共聚焦显微镜(IVCM)与传统的光学显微镜对睑缘蠕形螨的检出阳性率,评价其临床应用价值。方法 收集2020年10月—2021年2月期间就诊于中国中医科学院西苑医院眼科门诊的患者93例(186只眼)。对同一患者分别使用IVCM法与光学显微镜法检测蠕形螨感染情况,记录不同方法检测出的蠕形螨的阳性率、漏诊率和检出蠕形螨数量的分布情况,比较光学显微镜检查法检测上、下睑缘的检出率。结果 (1)阳性率:2种方法检测蠕形螨均为阴性的患者8例(8.60%)。IVCM检测阳性83例(89.25%),高于光学显微镜检测阳性的56例(60.22%),差异有统计学意义(χ^(2)=20.755,P=0.000)。(2)上、下睑缘检出蠕形螨阳性率:光学显微镜法检出上、下睑蠕形螨均为阳性或均为阴性的患者84例(90.32%),不一致的患者9例(9.68%)。(3)漏诊率:IVCM法漏诊3例(3.23%),低于光学显微镜法漏诊24例(25.81%),差异有统计学意义(χ^(2)=19.107,P=0.000)。(4)蠕形螨数量的分布情况:2种检查方法检xu出不同数量蠕形螨的分布情况比较,差异有统计学意义(χ^(2)=42.809,P=0.000);对于同一患者IVCM法计数结果高于光学显微镜法2倍以上的患者达73例(86.90%)。结论 与传统光学显微镜法比较,IVCM对睑缘蠕形螨的检出的阳性率更高,漏诊率更低,定量更为准确,具有一定的临床应用价值。

ZEISS LSM 780激光扫描共聚焦显微镜的三维成像及分析

针对ZEISS LSM 780激光扫描共聚焦显微镜的三维图像获取步骤做了系统的介绍,详述了光学切片的设置和获取过程,后期应用Zen2011 black和blue软件进行三维重构的渲染及图像分析、数据采集。列举出三维成像中常见问题及解决办法,使仪器为教学和科研工作提供更优质的服务。

原子力显微镜-扫描电子显微镜共定位表征系统的研发与应用

微纳加工过程中,常有样品需要进行聚焦离子束(FIB)溅射、切割,扫描电子显微镜(SEM)以及原子力显微镜(AFM)表征,而这三类仪器都需要将样品固定在样品台上才可测试,固定不佳会影响表征结果.但固定好的样品在不同仪器之间转移、拆卸、再固定的过程中极易受到破坏.基于以上问题,设计了AFM-SEM-FIB样品共定位系统,可实现样品在此三种仪器之间的无损转移及共定位,避免珍贵样品破坏及目标丢失,以及解决AFM扫描无法控制方向、迅速调整位点等问题.在微纳表征中有优异的表现,系统已被开发成产品并量产销售.

利用激光扫描共聚焦显微镜的肿瘤血管在体成像研究

传统的观察血管的方法需将组织制成切片,然后通过光学显微镜进行观察。显示的只是血管的某一片段,而无法观察到血管的全貌。应用激光扫描共聚焦显微镜,可对活体动物血管进行断层成像,从而再现血管的结构。本方法为对肿瘤等病变组织血管进行研究提供了一种新的检测手段。

应用共聚焦激光扫描显微镜对白癜风成像的观察与研究

目的应用共聚焦激光扫描显微镜观察白癜风皮损及周边皮肤图像特征。方法对46例白癜风患者69处皮损及周边皮肤进行共聚焦激光扫描显微镜检测,获得白癜风皮损特征性图像。结果皮损周边皮肤图像显示棘细胞层下部和基底层的角质细胞因含有黑素呈明亮的"圆形"或"椭圆形"色素环,皮损处图像显示色素环的数量及亮度呈不同程度减少或消失。结论共聚焦激光扫描显微镜是一项新的无创性皮肤影像技术,具有在体、实时、动态三维计算机断层成像的特点,可以直接观察到白癜风患者皮损处及周边角化细胞内黑素的形态变化,可为临床提供客观的评估依据。

激光共聚焦扫描显微镜载样台改造及使用

激光共聚焦扫描显微镜已经成为了生物科学研究中不可或缺的大型高端光学成像仪器。但由于生物样品来源和类型丰富,而购置的激光共聚焦显微镜单一形式载样台不能满足各类生物学样品的使用。本工作在Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜载样台的基础上,设计了一种能够避免原装载样台造成物镜撞击载物台并且能够更好的适应生物科研中各类成像样本的新载样台。改造结果显示更换载样台后,极大的降低了载物台撞显微镜物镜的概率,避免了显微镜物镜的损伤和因载样台的限制而不能进行成像造成样本的浪费,并且更加方便显微镜的日常使用。该次载样台改造的尝试为国内其他科研平台或仪器制造商提供了设计一种更好适应不同样品和物镜友好样品台的思路,具有很大的实用价值和借鉴意义。

扫描电镜原位激光加热与高温成像研究

扫描电子显微镜(SEM)原位研究材料高温组织与力学性能是近年来材料领域关注的一个重要方向,在扫描电子显微镜内进行原位加热实验可以直接揭示材料微观组织、力学性能与温度之间的关系。然而传统的电流加热方式在样品温度超过800℃时金属材料会释放出大量热电子,无法获得高质量图像。本研究开发了一种与SEM联用的激光加热台,该加热台使用激光作为加热源,可以对材料进行快速加热以及高分辨原位结构表征。本文详细介绍了激光加热台的设计原理并对加热台温度场进行有限元仿真模拟及分析,以镍基单晶高温合金为例,实现了1370℃原位高温成像,验证了该装置的主要功能。

共聚焦显微成像系统P9000图像质量评价临床研究

目的评价共聚焦显微成像系统P9000检测人体消化道相关组织的有效性和安全性。方法选取2021年8月至2022年6月在北京中医药大学东方医院和山东大学齐鲁医院行内镜检查的96例患者为研究对象。94例受试者纳入全分析集(Full Analysis Set,FAS),90例患者纳入符合方案集(Per Protocol Set,PPS)。通过多中心、随机、自身对照研究,统计共聚焦显微成像系统P9000与国际公认的Cellvizio®系统检测人体消化道相关组织的图像质量评分一致性和95%CI,以及两组的操作时间和不良反应发生情况。结果FAS和PPS两款器械图像质量评分一致性和95%CI分别为92.55%(87.25%~97.86%)和92.22%(86.69%~97.76%),两者95%CI下限均大于目标值84.6%;两组器械操作时间相当,差异无统计学意义(P>0.05);两组均无设备导致的不良反应发生。结论共聚焦显微成像系统P9000的临床使用有效性和安全性达到了设计要求,值得临床推广应用。