通用型动物转基因载体的构建及验证

为了构建通用型动物转基因载体,以pBluescriptⅡKS+为基础,根据标记基因所含酶切位点,设计改造多克隆位点,插入从pTARGET载体中扩增的SV40启动子及新霉素磷酸转移酶基因(Neo),其下游插入共表达序列、增强型绿色荧光蛋白质基因(EGFP)及SV40 poly A,并在SV40启动子上游和SV40 poly A下游各添加一个同向的LoxP位点,构建成通用载体pNIGFP,标记基因上游拥有Xho I、Sal I、SacⅡ多克隆位点,下游拥有Nhe I、Cla I、Sac I位点。酶切鉴定和测序表明pNIGFP构建正确。pNIGFP脂质体法转染山羊胎儿成纤维细胞,荧光显微镜下观察到EGFP高表达。遗传霉素(G418)筛选表明,Neo基因表达正常,山羊胎儿成纤维细胞的最适筛选浓度为600"g/ml。pNIGFP可利用G418进行抗性筛选,还可通过EGFP表达对外源基因的整合进行实时跟踪,另外,该载体具有LoxP位点,外源基因整合后可用Cre重组酶去除标记基因,具有高效、方便、安全的特点。