山羊颞下颌关节盘细胞的表面形貌和力学特性研究

目的采用JPK Nano Wizard 3型生物原子力显微镜(AFM)对两种类型的山羊颞下颌关节盘细胞(软骨细胞样细胞和成纤维细胞样细胞)的表面形貌和生物力学特性进行研究,为颞下颌关节盘组织工程研究中种子细胞的选择提供依据。方法单层培养原代山羊颞下颌关节盘细胞,生理状态下用AFM接触模式扫描两种类型的关节盘细胞,获得形貌图。随机选取20个软骨细胞样细胞和成纤维细胞样细胞,扫描获得细胞核区和细胞质区的力-位移曲线,通过JPK Data Processing软件分析两种细胞的杨氏模量和黏附力。结果 AFM下,三角形的软骨细胞样细胞的细胞核占据其大部分体积,细胞骨架结构呈树枝状排列,边缘伸出许多伪足;长梭形的成纤维细胞样细胞的细胞核明显高于细胞质区,骨架结构规则排列,边缘光滑,极少有伪足伸出;两种细胞的表面粗糙度没有明显差异。分析力-位移曲线得出:两种类型细胞的杨氏模量在细胞核区没有明显差异(P>0.05),在细胞质区略有差异(P=0.047);但两种细胞的黏附力没有明显差异(P>0.05)。结论两种类型的关节盘细胞在形貌上虽有较大的差别,但在生物力学特性上的差异并不明显。

山羊颞下颌关节盘细胞肌动蛋白骨架的研究

目的:通过激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)研究原代及传代山羊颞下颌关节盘细胞骨架(Cytoskeleton,CSK)蛋白-肌动蛋白的形态及蛋白量的改变,以说明关节盘细胞随着传代的发生,细胞骨架蛋白-肌动蛋白的差异。方法:原代(P0)山羊颞下颌关节盘细胞及传代1、2、3、4(P1、P2、P3、P4)代的关节盘细胞,分别接种在有方形盖玻片的6孔板中制作细胞爬片。对各代关节盘细胞肌动蛋白骨架进行免疫荧光染色,利用激光共聚焦显微镜获取各代关节盘细胞肌动蛋白的形态,同时利用荧光强度测定软件对各代关节盘细胞肌动蛋白荧光量进行测定。结果:丝状的肌动蛋白主要沿着细胞膜外围均匀排列,随着传代丝状结构逐渐清晰,且逐渐增粗,P4代时形成较粗的纤维束。荧光强度整体趋势是随着传代荧光量表达是递增的,P3代以内没有统计学差异,而在P4代时统计学差异明显。结论:肌动蛋白骨架随着传代过程形态学上发生了改变,在P4代时可见骨架蛋白形成较粗的纤维束,荧光量表达同其他代细胞差异明显,这为以后工程化颞下颌关节盘种子细胞的选择提供了依据。

原花青素对过氧化氢诱导羊颞下颌关节盘细胞氧化损伤的保护作用研究

目的探究原花青素在过氧化氢诱导颞下颌关节盘细胞氧化损伤中的作用。方法分别用浓度为0、100、200、400、800μmol/L过氧化氢处理颞下颌关节盘细胞12、24、48 h,CCK-8检测细胞活力。然后用不同浓度(0、5、10、20、40μmol/L)的原花青素处理颞下颌关节盘细胞24、48 h,CCK-8检测原花青素对颞下颌关节盘细胞活力的影响。将颞下颌关节盘细胞分为对照组、模型组、低浓度组(5μmol/L原花青素)、中浓度组(10μmol/L原花青素)、高浓度组(20μmol/L原花青素),使用CCK-8法检测细胞活力,比色法分别检测丙二醛水平、超氧化物歧化酶活性,DCFH-DA荧光探针检测活性氧水平,流式细胞仪检测细胞凋亡率,定量反转录PCR检测炎症因子、细胞外基质合成和降解因子相关基因的表达水平。结果400μmol/L过氧化氢处理24 h时,颞下颌关节盘细胞存活率为60.57%,与对照组相比,细胞活力降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组颞下颌关节盘细胞活力降低,活性氧水平、丙二醛水平升高,超氧化物歧化酶活性下降。与模型组相比,5、10、20μmol/L原花青素处理组可以提高过氧化氢诱导下颞下颌关节盘细胞活力,降低活性氧水平、丙二醛水平,升高细胞内超氧化物歧化酶活性(P<0.05)。流式结果显示模型组较对照组细胞凋亡率升高,而用原花青素干预后细胞凋亡率较模型组降低(P<0.05)。颞下颌关节盘细胞经过氧化氢干预后细胞内炎症因子(白介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白介素-6)表达量与对照组相比增加,原花青素预处理后白介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白介素-6表达降低(P<0.05)。此外,原花青素增加了过氧化氢诱导下Ⅰ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达(P<0.05),同时抑制了基质金属蛋白酶-1,基质金属蛋白酶-3,基质金属蛋白酶-9的表达(P<0.05),抑制了细胞外基质降解。结论建立颞下颌关节盘细胞氧化应激模型的最适作用条件为400μmol/L过氧化氢作用24 h。原花青素逆转了过氧化氢诱导的颞下颌关节盘细胞脂质过氧化、活性氧生成、炎症损伤和细胞外基质降解,通过提高抗氧化酶水平和减轻细胞凋亡来抑制氧化应激损伤。

静水压联合IGF-1干预对山羊颞下颌关节盘细胞丝状肌动蛋白表达影响的实验研究

目的探讨静水压联合IGF-1对体外单层培养的山羊颞下颌关节盘细胞丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)的影响,分析静水压、IGF-1与F-actin的关系变化对细胞生物学行为改变的影响。方法取4只1月龄山羊双侧颞下颌关节盘,采用酶消化法分离培养颞下颌关节盘细胞,以Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定。取第2、3代细胞根据干预方法不同分为4组:A组以完全培养基培养,作为对照;B组以强度0.2 MPa、频率1 Hz的静水压作用3 h;C组以含10 ng/mL IGF-1的完全培养基培养;D组采用静水压与IGF-1联合培养,方法同B、C组。于干预后24、72 h行免疫荧光染色观察F-actin变化,测定单个细胞荧光强度。结果经形态学观察及免疫组织化学染色鉴定,所培养细胞为颞下颌关节盘细胞。干预24 h时A、C组细胞荧光染色强,保持了细胞正常形态,且分布清晰;B组F-actin排列紊乱;D组F-actin变细,排列混乱。72 h时A、C组F-actin排列整齐;B组F-actin排列紊乱、模糊不清,部分F-actin断裂,形成伪足;D组F-actin变细,排列紊乱、断裂。随时间延长,A、B、D组荧光强度均呈增强趋势,两时间点间比较差异有统计学意义(P<0.05);C组两时间点间比较差异无统计学意义(t=0.284,P=0.781)。干预24 h,C组荧光强度最高,B组最低,与A、D组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。72 h时,B、D组荧光强度显著低于A、C组,差异有统计学意义(P<0.05);B、D组间及A、C组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论静水压可以引起山羊颞下颌关节盘细胞F-actin发生断裂及重排,IGF-1上调F-actin的表达;静水压联合IGF-1诱导产生的F-actin断裂、重排可能引起细胞生物学行为的改变。