利用RNA干扰抑制具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的表达

目的:构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白(RBPMS)基因siRNA的真核表达载体,观察其对RBPMS表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对RBPMS基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。将重组质粒和带FLAG标签的RBPMS共转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检验RNAi效应。结果:测序证明成功构建了RBPMSsiRNA真核表达载体;Western印迹表明构建的siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。结论:构建了RBPMSsiRNA的真核表达载体,该siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。

RBPMS不同剪接体的真核表达和亚细胞定位

目的：构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）基因的真核表达载体，并在真核细胞中表达，确定不同形式的RBPMS在细胞中的定位。方法：采用PCR技术从人卵巢cDNA文库中扩增RBPMS基因的几种完整编码序列（命名为RBPl～RBP4），克隆到带绿色荧光蛋白标签的pEGFP-C1表达载体上，转染人胚肾细胞293T，Western印迹鉴定RBPMS的表达，并利用激光共聚焦显微镜观察RBPMS不同剪接体在细胞中的定位。结果：限制性内切酶分析和DNA序列测定表明构建的重组表达载体正确，Western印迹实验证明RBP1～RBP4表达成功。通过激光共聚焦显微镜观察，RBP1／4围绕胞核在核膜的周围呈聚集状分布；RBP2则在细胞质和细胞核中均有分布，但会出现斑点状聚集；RBP3呈半月状紧密分布在细胞核周围；RBPMS中的RNA识别基序缺失后，这种现象消失，与空载体对照类似，在细胞核和细胞质中均有分布。结论：构建并表达了RBPMS基因的真核表达载体，RBPMS不同剪接体及RNA识别基序缺失后具有不同的亚细胞分布模式，提示具有不同的功能。