养阴活血方药对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及机制探讨

目的:探讨养阴活血方药(nourishing yin and promoting blood flow recipe,NYPBR)对糖尿病大鼠肾脏的保护作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组和NYPBR组,后两组大鼠腹腔注射链脲佐菌素复制糖尿病模型。正常组和模型组自由饮水。NYPBR组按人与动物间体表面积折算的等效剂量比值灌喂给药(含生药1 g·mL^(-1)),每只大鼠3 mL·d^(-1)。10周后,RT-PCR检测肾皮质诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA表达,Western blot检测iNOS蛋白含量,免疫组化检测过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO^-)特异性标志物-硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)的生成。光镜观察大鼠肾皮质形态学变化。检测各组大鼠肾皮质超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及血糖、24 h尿蛋白定量和肌酐清除率。结果:与正常组相比,模型组肾皮质iNOS mRNA表达0.90±0.10和蛋白量含量43.00±6.08增加、NT生成87.23±5.94明显增加,与肾皮质病理改变及肾功能减退呈一致性变化。NYPBR可显著改善上述变化。结论:NYPBR可显著减轻糖尿病大鼠的肾脏损伤,此作用可能与降低iNOS mRNA表达和蛋白含量、减少ONOO^-的生成有关。

养阴活血方药对糖尿病大鼠主动脉内皮损伤的保护作用

目的:探讨养阴活血方药(Nourishing Yin and Promoting Blood FlowRecipe,NYPBR)对糖尿病大鼠主动脉内皮损伤的保护作用机制。方法:采用链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型,随机分为正常对照组、模型组和NYPBR组。正常对照组和模型组自由饮水。NYPBR组按人与动物间体表面积折算的等效剂量灌胃给药(含生药1 g/mL),每只大鼠3 mL/d。13 w后,RT-PCR检测主动脉诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA表达,Western blotting检测iNOS蛋白含量,免疫组化检测过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-)特异性标志物硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)的生成。光镜、扫描电镜观察大鼠主动脉内皮形态学变化。并测定大鼠血浆中内皮素-1(endothelin-1,ET-1)、血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)以及血清SOD活性、MDA含量等生化指标的变化。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠主动脉iNOS mRNA表达及iNOS蛋白含量增加,NT生成明显增加,与主动脉内皮病理变化呈一致性。NYPBR可显著改善上述变化。结论:NYPBR可显著减轻糖尿病大鼠的主动脉内皮损伤,此作用可能与降低iNOS mRNA表达及iNOS蛋白含量、减少ONOO-的生成有关。

养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏的氧化应激水平及病理改变的影响

目的探讨养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏氧化应激水平及病理改变的影响。方法采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)造糖尿病大鼠模型,挑选造模成功的大鼠,随机分为四组:糖尿病模型组;中药6周组,中药8周组,中药10周组,另外随机选出8只作为正常对照组,造模成功后分别于6、8、10周取材,测定肝组织氧化指标并进行病理观察。结果与正常对照组比较,糖尿病模型组的丙二醛(MDA)的含量明显增加(P<0.01),超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性明显降低(P<0.01)。与糖尿病模型组相比,中药干预组各阶段MDA的含量明显减少(P<0.05或P<0.01),中药8周组和中药10周组SOD活性和GSH-Px活性均有显著升高(P<0.05或P<0.01),中药6周组虽有升高SOD活性和GSH-Px活性的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。病理学观察,模型组肝细胞索及肝小叶结构紊乱,炎症细胞增多,说明肝组织有损伤。与模型组比较,中药干预组各阶段形态学改变均有改善。结论养阴活血方药具有一定的抗氧化能力,抑制氧化应激,对糖尿病大鼠肝脏具有一定的保护作用。

养阴活血方药对糖尿病大鼠肾脏线粒体氧化应激损伤的影响

目的探讨养阴活血方药对糖尿病大鼠肾脏线粒体氧化应激损伤的影响及相关机制。方法将SD大鼠分为三组,正常对照组(NC组)、糖尿病对照组(DM组)和养阴活血方药治疗组(NYPBR组),后两组应用链脲佐菌素(STZ)制造糖尿病大鼠模型。NYPBR组大鼠给予养阴活血方药防治。10周末,测定各组大鼠血糖、体重、肾重、血肌酐(SCr)、24 h尿蛋白,检测肾脏线粒体丙二醛(MDA)含量及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性,透射电镜观察肾组织超微结构变化。结果与NC组比较,DM组大鼠肾脏线粒体MDA[(1.34±0.24)nmol/mg]、GSH-Px[(57.63±4.91)U/mg]及NOS[(0.81±0.07)U/mg]明显升高(均P<0.01),Na+-K+-ATP酶[(1.40±0.10)μmol/(mg·h)]、Ca2+-Mg2+-ATP酶[(1.43±0.10)μmol/(mg·h)]和SDH[(24.33±2.31)U/mg]显著降低(均P<0.01),肾功能减退,肾脏组织发生病理性改变,线粒体出现损伤。养阴活血方药可显著改善上述变化,NYPBR组的MDA[(0.81±0.08)nmol/mg]、GSH-Px[(50.55±5.86)U/mg]及NOS[(0.72±0.07)U/mg]均低于DM组(P<0.01或P<0.05),Na+-K+-ATP酶[(1.66±0.18)μmol/(mg·h)]、Ca2+-Mg2+-ATP酶[(1.76±0.20)μmol/(mg·h)]和SDH[(40.92±3.77)U/mg]明显上升(P<0.05或P<0.01)。结论糖尿病大鼠肾脏线粒体存在明显的氧化应激损伤,NYPBR可显著减轻糖尿病大鼠肾脏线粒体损伤,此作用可能与降低NOS活性,提高SDH、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性有关。

养阴活血方药对糖尿病大鼠肾皮质氧化应激损伤的保护作用

目的:通过观察养阴活血方药对糖尿病(DM)大鼠肾皮质一氧化氮合酶(NOS)及过氧亚硝基(ONOO-)水平的影响,探讨养阴活血方药对糖尿病大鼠肾皮质氧化应激损伤的保护作用。方法:将16只SD大鼠采用链脲佐菌素(STZ)复制糖尿病大鼠模型造模,造模成功后,随机分为糖尿病对照组(DM组,n=8)和养阴活血方药组(NYPBR组,n=8),另设8只健康SD大鼠为正常对照组(NC组)。NYPBR组给予养阴活血方药干预。至10周末,检测各组大鼠肾皮质丙二醛(MDA)含量及超氧化物岐化酶(SOD)、总NOS(TNOS)、诱导型NOS(i NOS)和固有型NOS(c NOS)的活性,免疫组化检测肾皮质ONOO-特异性标志物硝基酪氨酸(NT)的生成,检测各组大鼠血糖、体质量、肾质量、24小时尿蛋白及血肌酐。结果:与NC组相比,DM组大鼠肾皮质MDA[(1.78±0.16)nmol/mgprot]水平升高(P<0.05),SOD[(68.96±3.82)U/mgprot]活性下降,TNOS(3.44±0.30)U/mgprot与i NOS(2.54±0.21)U/mgprot活性显著升高,NT[(42.66±3.14)]生成明显增加,肾质量/体质量、24小时尿蛋白、血肌酐水平显著升高。上述指标2组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。干预后,BYPBR组肾质量/体质量、24小时尿蛋白、血肌酐较DM组均有明显改善,MDA[(1.56±0.08)nmol/mgprot]下降,SOD[(76.44±4.90)U/mgprot]升高,iNOS[(2.54±0.21)U/mgprot]活性和NT(26.19±1.58)生成均显著降低,上述指标组内比较差异均有统计学意义(P<0.05)。c NOS 3组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:NYPBR可显著减轻糖尿病大鼠肾皮质氧化应激损伤,此作用可能与提高SOD活性,降低i NOS活性及ONOO-的生成有关。

养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏线粒体琥珀酸脱氢酶和三磷酸腺苷酶的影响

目的探讨养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)和三磷酸腺苷酶(ATP酶)活性的影响。方法选取SD大鼠24只,随机分为三组:正常对照组,糖尿病模型组,中药干预组。除正常对照组外,其他两组腹腔注射链脲佐菌素(STZ)造糖尿病模型。正常对照组和糖尿病模型组自由饮水,中药干预组按人与动物间体表面积折算的等效剂量比值灌喂给药。造模成功后10周,股动脉放血,并取肝脏,提取大鼠肝脏线粒体,并测定SDH和ATP酶活性的变化,观察肝细胞线粒体超微结构。结果与正常对照组[(3.91±0.43)U/mgprot]比较,糖尿病模型组大鼠肝脏线粒体SDH[(2.31±0.27)U/mgprot]活性显著降低(P<0.01),Na+-K+-ATP酶[(0.57±0.18)U/mgprot]活性显著低于对照组[(2.39±0.28)U/mgprot](P<0.01),Ca2+-Mg2+-ATP酶[(0.95±0.19)U/mgprot]活性显著低于对照组[(2.18±0.09)U/mgprot](P<0.01),肝组织透射电镜观察:肝细胞线粒体空泡化,线粒体嵴、膜大部分融合、消失,粗面内质网脱颗粒现象明显。与糖尿病模型组相比,中药干预组SDH[(3.39±0.29)U/mgprot]、Na+-K+-ATP酶[(1.70±0.22)U/mgprot]和Ca2+-Mg2+-ATP[(1.75±0.09)U/mgprot]酶活性均有显著升高(P<0.01),肝组织透射电镜观察:细胞线粒体无空泡,损伤程度轻。结论养阴活血方药可有效提高大鼠肝脏线粒体SDH活性、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,这可能是养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏线粒体保护作用机制之一。

养阴活血方药拮抗环孢素慢性肾毒性的大鼠体内实验研究

目的探讨养阴活血方药拮抗环孢素(CsA)慢性肾毒性的作用及机制。方法将50只Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为对照组、依那普利组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组,每组各10只。采用钠耗竭法制作大鼠CsA肾毒性模型:给予钠缺乏饮食,每日皮下注射CsA12.5mg/(kg·d),连续4周。同时,按组别相应予以蒸馏水、依那普利(依那普利10倍成人剂量)、低剂量中药(养阴活血方药5倍成人剂量)、中剂量中药(养阴活血方药10倍成人剂量)、高剂量中药(养阴活血方药20倍成人剂量)灌胃。建组后14d、28d记录各组大鼠死亡率。建组后7d、14d、21d、28d,测定各组大鼠的血清肌酐(Scr)、尿肌酐、24h尿蛋白定量,计算内生肌酐清除率(Ccr)。建组后28d处死大鼠,取右肾组织进行病理学检查和免疫组织化学染色,观察细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分,包括纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、胶原蛋白(collagen,Col)Ⅳ和其调节因子转化生长因子(TGF)-β1的表达;取左肾组织进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),分别检测FN、ColⅣ、TGF-β1,以及抑制ECM生成基因包括组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,tPA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-plasminogen activator,uPA)、纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor,PAI)-1基因的核糖核酸(RNA)表达。结果建组后14d,中药高剂量组的死亡率为20%,依那普利组和对照组各为10%,中药中剂量组、中药低剂量组均无死亡。建组后28d,除中药高剂量组的死亡率为20%、中药低剂量组的死亡率为0外,其余3组死亡率均为10%。建组7d后各组大鼠肾功能逐渐恶化,24h尿蛋白定量增加,于建组后14d达到高峰。建组14d后进入CsA慢性肾毒性期,各治疗组大鼠的肾功能均有所改善、24h尿蛋白定量减少,但对照组仍然继续恶化。建组后28d,中药高剂量组和中药中剂量组的Ccr明显高于对照组(均为P<0.05),中药各剂量组及依那普利组的24h尿蛋白定量均低于对照组(P<0.05或P<0.01)。肾组织病理切片常规苏木素-伊红(HE)染色表现为慢性CsA肾毒性肾间质纤维化,以对照组改变最为严重,依那普利组、中药低剂量组、中药中剂量组及中药高剂量组改变依次减弱。马松(Masson)染色可见肾小管及肾小球周围纤维增生,以对照组最为明显。免疫组织化学染色显示对照组的FN、ColⅣ及TGF-β1表达遍布肾小管皮质和髓质,依那普利组及中药各剂量组表达程度较轻。RT-PCR结果提示,FN基因的信使RNA(messenger RNA,mRNA)表达强度以中药高剂量组最低、对照组最高;ColⅣ基因的mRNA表达强度以中药低剂量组最高,中药高剂量组最低;TGF-β1基因的mRNA表达强度以依那普利组、中药高剂量组最低,中药低剂量组表达最高。作为抑制ECM生成的tPA、uPA和PAI-1基因的mRNA在各组表达强度差异均无统计学意义。结论养阴活血方药有类似依那普利拮抗大鼠CsA慢性肾毒性的作用,但对急性肾毒性无保护作用,其作用机制可能与下调TGF-β1等细胞因子,从而抑制ECM的合成有关。