稀有鮈鲫Dmrt基因家族13个成员的克隆与序列分析

已经发现果蝇Doublesex、线虫Mab-3、青DMRT1Y/DMY和人类DMRT1等性别决定与分化基因均含有一个具有DNA结合能力的保守基序--DM结构域,对性别决定和性别分化具有调控功能.利用简并PCR,从稀有鲫基因组DNA中克隆了13个具有不同DM结构域的Dmrt基因家族成员.基于DM保守基序,建立了各物种的进化树.结果表明,稀有鲫基因组存在多个Dmrt基因成员,该基因在脊椎动物和非脊椎动物中具有高度保守性,是一种理想的环境内分泌干扰物研究的分子模型,在分子生态毒理学研究中具有很好的应用前景.

利用Site-Finding PCR克隆琼胶酶基因

目的:新型琼胶酶基因的筛选。方法:根据α-琼胶酶基因序列的同源性,设计了兼并引物,利用兼并PCR对所筛选到的琼胶酶产生菌株进行筛选,阳性菌株进行16s rDNA序列测定并构建了进化树。利用染色体步移技术Site-finding PCR获得目的基因的上下游序列,经过拼接获得全长的目的基因序列,并利用Blast对其进行分析。将目的基因插入pET 24a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用平板水解圈初步鉴定了重组酶的性质,并利用DNS法检测了重组酶发酵上清液的酶活。结果:获得了一株疑似α-琼胶酶产生菌株,16s rDNA序列鉴定显示为Thalassomonas sp.,命名为Thalassomonas sp.LD5。获得了一个新的基因,命名为agaD。agaD开放阅读框长4401 bp,编码1466个氨基酸,理论分子量为158.8kDa。序列分析表明,agaD编码的蛋白AgaD与已有的两种α-琼胶酶的相似性分别为89%和77%。重组AgaD经诱导后可以直接降解琼胶平板产生水解圈,其发酵上清液酶活为0.2 U.ml-1,说明该蛋白为琼胶酶。结论:采用分子克隆技术分离出新的琼胶酶基因,该基因的发现为活性寡糖的制备提供了新的工具。