拟南芥液泡分拣蛋白AtVPS25调控植物生长素响应的功能分析

【目的】鉴定生长素胁迫条件下纯合突变体vps25的表型,获得拟南芥液泡分选蛋白AtVPS25的互作蛋白,并分析AtVPS25和其互作蛋白在生长素响应过程中的功能及其分子机制。【方法】根据"三引物法"鉴定突变体;通过观察拟南芥vps25突变体在外加生长素的培养基上的表型,鉴定AtVPS25的功能;以AtVPS25为诱饵蛋白,采用泛素分离系统筛选在拟南芥中与其互作的蛋白;利用酵母互作试验和双分子荧光互补试验(BiFC)验证AtVPS25与AtAIR12(for Auxin-Induced in Root cultures)的互作关系;鉴定AtVPS25和AtAIR12蛋白在植物细胞中的定位情况;采用Real-time PCR方法,分析在生长素处理条件下,部分生长素运输相关基因在拟南芥vps25突变体中的表达变化。【结果】Real-time PCR结果显示,10μmol·L-1 IAA处理条件下,在野生型拟南芥(WT)中,AtVPS25的表达量随着胁迫时间的增长而增高,并在12 h达到最高,约为0 h的40倍,证明AtVPS25受生长素处理的诱导表达。利用泛素分离系统筛库获得AtVPS25的互作蛋白AtAIR12、AtVPS25与AtAIR12全长蛋白序列的酵母双杂交试验证明AtVPS25与AtAIR12互作。亚细胞定位试验证明AtVPS25定位在细胞膜和细胞质中,AtAIR12定位在细胞膜及叶绿体膜上。BiFC(双分子荧光互补)试验结果显示,AtVPS25蛋白与AtAIR12蛋白互作,并且互作位点在细胞膜和细胞质中。突变体鉴定获得纯合突变体vps25。vps25在0.1 mg·L-1 IAA条件下生长,表现为主根伸长受到抑制,并且相对同一条件下的WT的主根长度差异极显著(P<0.01),而同时侧根数无明显差异,这与已报道的air12-1突变体在生长素处理条件下的表型相似。10μmol·L-1 IAA处理时,在WT背景条件下,AtAIR12的表达量对IAA响应明显,并且随着胁迫时间的增长而增高,在12 h时达到最高,约为0 h的80倍,证明10μmol·L-1 IAA处理条件下,WT中AtAIR12表达量的变化趋势与AtVPS25完全相同。同时在vps25突变体背景条件下,AtAIR12的表达相对于WT受到抑制,在0-24 h表达量无明显变化。此外,在vps25突变体背景条件下,生长素输出载体基因AtPIN2相对于WT中表达量降低,生长素输入载体基因AtLAX2相对于WT中表达量提高。【结论】拟南芥液泡分拣蛋白基因AtVPS25受IAA诱导表达,参与调控植物主根的发育,AtVPS25可以与生长素响应蛋白AtAIR12在细胞质和细胞膜上互作,AtVPS25调控部分生长素相关基因的表达,AtVPS25通过调控这些下游基因的表达影响生长素在根部的响应。AtVPS25与AtAIR12的调控机制需要进一步深入研究。

ESCRT系统:一个多功能的蛋白转运及膜剪切机器

转运必需内体分选复合物(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)系统是真核细胞中完成内体(endosome)膜内陷以形成多囊泡体(multi-vesicular body,MVB)的分子机器.其主要功能是促进被泛素(ubiquitin)标记的膜蛋白的降解,还与细胞分裂、病毒出芽、细胞自噬以及真菌pH感知相关.ESCRT系统包括ESCRT-0,-Ⅰ,-Ⅱ,-Ⅲ和Vps4-Vta1共5个蛋白-蛋白复合物.晶体学研究已经解析了大部分复合物的结构.其促使膜内陷的分子机理一般认为分3步.首先是ESCRT-Ⅰ和-Ⅱ在内体膜上结合并促使内体膜内陷形成初始芽体.之后,ESCRT-Ⅲ在芽体颈部聚合并导致芽体的剪切,从而将内腔囊泡(intralumenal vesicles,ILVs)释放到内体腔内,形成MVB.最后,Vps4/Vta1复合物则以水解ATP提供能量将聚合的ESCRT-Ⅲ解聚以循环使用,完成更多的出芽过程.本文将对ESCRT系统的结构、出芽机理和生物功能几方面做一个综述.

多功能分子机器ESCRT的研究进展

20世纪中叶，研究者发现多种真核细胞晚期内吞体中存在大量的内腔囊泡，并称之为多囊泡体，但其形成机制一直未能阐明。直到21世纪初，转运必需内体分选复合物（endosomalsortingcomplexrequiredfortransport，ESCRT)在酵母和哺乳动物细胞中被鉴定出[1]，开启了在分子水平上探索多囊泡体的深入研究。大量研究发现，ESCRT不仅在多囊泡体途径发挥作用[2]，还参与胞质分裂[3]、病毒出芽[4_7]、细胞凋亡[8]、细胞自嗟[9_1°]、基因沉默[11]、蛋白的质量控制[12]、信号转导调控（EGF、Notch、Wnt、JAK-STAT、Hedgehog)[13_16]、质膜损伤的修复及核膜重整[1749]等重要生命过程，而且在肿瘤及神经退行性疾病的发生、发展中也起重要作用[2°41]。

ESCRT机制对阿尔茨海默病作用的研究进展

阿尔茨海默病(AD)是人类衰老过程中影响老年人智力、自理能力以及致残和新的致死病因的重大疾病之一。神经元中tau蛋白的过度磷酸化以及β淀粉样蛋白(Aβ)的沉积是AD发病的主要假说,目前仍无有效治疗AD的方案。转运必需内体分选复合物(ESCRT)在蛋白质降解及维持细胞结构完整、功能稳定方面发挥重要作用。ESCRT识别分类泛素化的病理tau蛋白及Aβ产生多囊泡体进入溶酶体降解或分泌,从而减轻tau蛋白及Aβ的神经元毒性作用。此外,ESCRT还能修复神经元突触的损伤,减少神经元的凋亡。因此,ESCRT机制的研究可能为治疗和延缓AD的进展提供新的研究思路和方向。

过表达带电多泡体蛋白2B基因抑制肾透明细胞癌细胞的增殖

目的肾透明细胞癌中带电多泡体蛋白2B(CHMP2B)的表达水平与临床病理特征及预后的关系,探究CHMP2B在肾透明细胞癌发生发展中的潜在作用机制。方法从TCGA数据库下载并整理肾透明细胞癌的RNAseq数据并提取FPKM格式的数据,比较肿瘤样本与癌旁样本CHMP2B的表达差异,根据其表达中位值分为高、低表达组,分析CHMP2B表达水平与临床病理特征的相关性,采用Kaplan-Meier模型进行生存分析,COX风险回归模型用于临床预后因素分析;使用ESTIMATE算法分析CHMP2B与免疫和基质细胞浸润及肿瘤纯度的关系;使用Limma包对CHMP2B筛选共表达基因,并进一步行GSVA富集分析。使用ESTIMATE算法和Timer数据库分析CHMP2B表达与免疫浸润的相关性;使用cBioPortal数据库分析CHMP2B的基因突变对肾透明细胞癌免疫治疗的影响;从HPA数据库获取CHMP2B蛋白质在肾透明细胞癌组织和正常组织的免疫组化表达情况;通过收集健康与肾癌患者外周血标本评价CHMP2B作为临床标志物的可能。通过细胞实验验证CHMP2B对肾癌细胞增殖与迁移的影响。结果与癌旁组织相比较,CHMP2B在肾透明细胞癌组织中低表达,使其过表达会抑制肿瘤细胞增殖(P<0.01),其表达水平与年龄、性别、是否淋巴结转移以及分期等具有相关性(P<0.05)。生存分析结果显示CHMP2B低表达肾透明细胞癌患者生存预后更差(P<0.05),富集差异分析及共表达基因富集发现CHMP2B在肾透明细胞癌中主要涉及病毒出芽、坏死性凋亡、内吞作用等,并涉及免疫调节过程。结论CHMP2B在肾透明细胞癌组织中低表达,可有效影响肿瘤进展和肿瘤免疫过程,是一种有前途的预后分子标志物及治疗靶点。

ESCRT与TORC1共同调控微自噬

微自噬是真核生物体利用溶酶体直接降解蛋白质和受损细胞器的过程,在维持细胞稳态和生长发育中发挥重要作用。作为影响自噬流进程的关键复合物,内体分选转运复合体(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)和雷帕霉素靶蛋白复合体1(target of rapamycin complex 1,TORC1)在微自噬的调控通路中存在协同作用。本文通过系统性归纳并总结ESCRT与TORC1共同调控微自噬的分子机制,同时比较在不同类型的自噬中调控机制的差异,分析该领域仍存在的一些未解之谜,为发现调控自噬的新型分子机制提供可行性思路,为人类自噬相关疾病药物的研究提供潜在新靶点。