厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达

里氏木霉(Trichoderm reesei)是重要的纤维素酶生产菌,为了显著提高其产酶性能,拟利用分子生物学技术构建高产的基因工程菌株。将前期优化后的瘤胃厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因af 2置于里氏木霉纤维二糖水解酶I强启动子Pcbh1(及其信号肽)和终止子Tcbh1之间,并进一步以pCAMBIA1300为载体骨架,构建成含潮霉素B抗性标记的重组质粒pCB-hF。以里氏木霉ZU-02为宿主,采用优化的根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒转入经萌发处理的分生孢子。以潮霉素B为抗性标记初筛到318个阳性转化子,进一步接种到以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的筛选培养基上,复筛到8株生长较快的转化子。以重组转化子基因组DNA为模板,分别进行PCR检测,均可获得目的基因片段,表明厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因已整合到里氏木霉的染色体DNA上。在摇瓶条件下,分别对8个重组转化子进行产酶试验,获得3个高产内切-β-葡聚糖酶活力的转化子。发酵培养96 h时,发酵液的内切-β-葡聚糖酶活力最高可达到126.3 IU?mL-1左右,是出发菌株的4.23倍。研究结果表明:厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因已在里氏木霉细胞中得到高效表达并实现了胞外分泌。