大豆斑疹病菌内切甘露聚糖酶ManA的功能研究

为探析大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv.glycines,Xag)基因组中唯一注释编码内切甘露聚糖酶(mannan endo-1,4-β-mannosidase,ManA)基因是否参与Xag的内切甘露聚糖酶活性及其他功能,采用同源重组策略创制了Xag的manA基因缺失突变株(ΔmanA),并对该突变株进行功能分析.结果表明:相对于野生型,该突变株的胞外纤维素酶活性和内切甘露聚糖酶活性均显著增强,而且能形成明显的胶状物;功能互补使ΔmanA的上述3种表型均恢复至野生型水平;manA基因突变不影响菌株的生物膜形成、胞外多糖合成及蛋白酶和淀粉酶活性;负责胞外纤维素酶合成的egl2和engXCA基因也共同控制Xag的内切甘露聚糖酶活性;荧光定量PCR结果显示,ManA涉及负调控egl2和engXCA基因的表达.总之,manA基因突变导致egl2和engXCA基因的表达水平上调,从而增强菌株的内切甘露聚糖酶活性.研究为深度解析植物病原黄单胞菌Ⅱ型分泌系统胞外酶类的生物学特性提供了科学线索.

里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切β甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IUmL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50%以上。

置换β-甘露聚糖酶底物结合槽内环结构序列改善其酶学特性

位于酶分子活性位点（又称活性中心）附近的环结构对酶促反应特性具有重要影响.本实验室先前在宇佐美曲霉Aspergillus usamii中发现了一种新的5家族β-甘露聚糖酶Au Man5A.通过同源建模、分子对接及多序列比对,发现位于Au Man5A底物结合凹槽侧壁的一段环结构可能对酶的功能有影响.为证明该假说,本研究采用Au Man5A为母本,利用PCR技术将其底物结合槽内的7肽环结构316KSPDGGN322替换成与两种木霉属β-甘露聚糖酶对应的8肽片段AQSNSDPY,构建了杂合酶基因Auman5ALoop,并在毕赤酵母GS115中进行表达,经纯化获得了杂合β-甘露聚糖酶Au Man5ALoop.酶学特性分析结果显示,与原酶Au Man5A比较,Au Man5ALoop的最适反应p H由3.5~4.0扩宽至3.5~5.5;最适反应温度由65℃提高至70℃;以角豆胶为底物,测得Au Man5ALoop的比活性由351.2 U/mg提高至2 089.2 U/mg.利用双倒数作图法测得动力学常数揭示,Au Man5ALoop的Km值较Au Man5A降低了36%,而kcat值是Au Man5A的6.8倍;同时,Au Man5ALoop的催化效率（kcat/Km）提高了10.7倍.我们的结果说明,通过替换Au Man5A底物结合槽内环结构,可明显改进其酶学特性.我们的结果还提示,活性位点附近的环结构对β-甘露聚糖酶的酶学特性具有重要影响.

基于内切-1,4-β-甘露聚糖酶水解的黄芪糖指纹图谱的建立及不同种质资源黄芪鉴别

以内切-1,4-β-甘露聚糖酶的最佳酶解条件对不同种质资源蒙古黄芪（移栽芪和野生芪）和膜荚黄芪（移栽芪和野生芪）多糖进行酶解,通过荧光辅助糖电泳获得糖指纹图谱,利用主成分分析对数据进行分析,获得区分不同种质资源黄芪的差异性糖组分。结果显示,内切-1,4-β-甘露聚糖酶酶解产物中三糖、四糖和五糖可以作为区分蒙古黄芪（移栽芪和野生芪）的差异性糖片段,五糖和六糖可以作为区分膜荚黄芪（移栽芪和野生芪）的差异性糖片段,三糖和四糖可以作为区分移栽蒙古黄芪和移栽膜荚黄芪的差异性糖片段。研究表明,内切-1,4-β-甘露聚糖酶降解的多糖产物能很好地鉴别黄芪种属（蒙古黄芪与膜荚黄芪）,生长方式（移栽芪和野生芪）。该研究为黄芪药材的品质评价及活性寡糖的筛选奠定了基础。

Endo-Glycanhydrolases Activities in Artemisia sphaerocephala (Asteraceae) Mucilaginous Achene Germination Process

对白沙蒿 (ArtemisiasphaerocephahaKrasch .)种子萌发不同阶段的种胚提取物中几种可能降解果皮外层粘液物质的多糖内切酶进行了检测。研究结果表明 :多聚半乳糖醛酸酶在干燥胚中已存在并具较高的活性 ,但其活性随着种子吸涨及萌发而降低。此酶并不释放到种胚外。β 甘露聚糖内切酶随着种子的吸涨而增加并被萌发的种胚释放到种子外。纤维素酶在种子萌发的过程中不表现出活性。提取物中的所有多糖内切酶都无法降解果皮外层的粘液物质。